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丁型肝炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Hepatitis D Virus(HDV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

丁型肝炎病毒（Hepatitis Delta Virus，HDV）是一種缺陷病毒，必須在 HBV 或其他嗜肝 DNA 病毒的輔助下才能復(fù)制增殖。HDV 與 HBV 重疊感染后， 可促使肝損害加重，并易發(fā)展為慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化和重型肝炎。HDV 的 感染呈世界性分布，但主要分布于南意大利和中東等地區(qū)，主要通過(guò)輸血、密切 接觸和母嬰傳播。HDV 給人類(lèi)健康造成重大威脅，因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具 有重要的意義。本產(chǎn)品基于 PCR 原理開(kāi)發(fā)。它具有下列特點(diǎn)：

1.一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。
2. 根據(jù) HDV 的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。 
3.基于染料法qRT-PCR檢測(cè)，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。
4.使用一管式qRT-PCR技術(shù)，RT和PCR兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

丁型肝炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒??規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。陽(yáng)性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供RNA段作為陽(yáng)性對(duì)照。

自備試劑  樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非 常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑 盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣 品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的的 DNA 段作為陽(yáng)性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒 光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

2. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(本試劑盒提供)，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

5. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。 二、樣品 RNA 的制備

6. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性 對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL 上步制備的陽(yáng)性對(duì)照 梯度稀釋液中的第 4 號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝） 再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品 體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫?duì)照。

7. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提 取試劑盒兼容。 

三、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

8. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 RT-PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于 RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照。

9. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分： 

10. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR（參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化）。

四、數(shù)據(jù)處理

10. 如果PCR陽(yáng)性對(duì)照和PCR陰性對(duì)照均得到預(yù)期陽(yáng)性和陰性結(jié)果，則說(shuō)明PCR 有效，可以進(jìn)行后續(xù)分析。以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

11. 如果 PCR 陽(yáng)性對(duì)照或 PCR 陰性對(duì)照任何一個(gè)沒(méi)有得到預(yù)期陽(yáng)性和陰性結(jié)果， 則說(shuō)明 PCR 實(shí)驗(yàn)無(wú)效或污染，不需要進(jìn)行后續(xù)分析，請(qǐng)跟廠家聯(lián)系。

12. 如果樣品制備陽(yáng)性對(duì)照或樣品制備陰性對(duì)照均得到預(yù)期陽(yáng)性和陰性結(jié)果，說(shuō) 明樣品制備操作有效，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

13. 如果樣品制備陽(yáng)性對(duì)照或樣品制備陰性對(duì)照任何一個(gè)沒(méi)有得到預(yù)期結(jié)果（如 樣品制備陽(yáng)性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，或樣品制備陰性對(duì)照有擴(kuò)增），說(shuō)明樣品制備操作 無(wú)效或有污染，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，需要重復(fù)樣品制備過(guò)程或請(qǐng)跟廠家聯(lián)系。