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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0359	應用領域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產業(yè),農業(yè)
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴增效率、更高的擴增靈敏度、更高的擴增特異性。

丁型肝炎病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

Hepatitis D Virus(HDV)

產品及特點

丁型肝炎病毒（Hepatitis Delta Virus，HDV）是一種缺陷病毒，必須在 HBV 或其他嗜肝 DNA 病毒的輔助下才能復制增殖。HDV 與 HBV 重疊感染后，可促使肝損害加重，并易發(fā)展為慢性活動性肝炎、肝硬化和重型肝炎。HDV 的感染呈世界性分布，但主要分布于南意大利和中東等地區(qū)，主要通過輸血、密切接觸和母嬰傳播。HDV 給人類健康造成重大威脅，因此靈敏快捷的診斷產品具有重要的意義。本產品以探針法熒光定量 RT-PCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測丁型肝炎病毒的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2. 引物和探針經過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據丁型肝炎病毒高度保守區(qū)設計，不會跟其他病毒的 RNA 發(fā)生交叉反應。

5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。

6. 本產品只能用于科研。

丁型肝炎病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成分	規(guī)格
試劑一	探針法 qRT-PCR 緩沖液	500μL（藍蓋）
試劑二	探針法 qRT-PCR 酶混合液	100μL（紅蓋）
試劑三	熒光 PCR 模板稀釋液	1 mL（亮黃蓋）
試劑四	丁型肝炎病毒探針法 qRT-PCR 引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑五	丁型肝炎病毒 qRT-PCR 探針	50 μL（棕色管））
試劑六	丁型肝炎病毒探針法 qRT-PCR 陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)	50 μL（黃蓋）
試劑七	使用手冊	1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品，設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

成分	樣品管 N+2 個	PCR 陰性對照管	標準曲線樣品管（2-7 管）
探針法 qRT-PCR 緩沖液	各10 μL	10 μL	各10 μL
探針法 qRT-PCR 酶混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
丁型肝炎病毒 qRT-PCR 探針	各 1 μL	1 μL	各1 μL
丁型肝炎病毒探針法 qRT-PCR 引物混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
待測樣品 RNA 模板	各 5 μL
超純水		5 μL
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7 號）			各 5 μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…）

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR：

過程	溫度	時間
逆轉錄	50℃	30 min
預變性	94℃	10 min
qRT-PCR 反應（40 個循環(huán)）	94℃	15sec
qRT-PCR 反應（40 個循環(huán)）	60℃	1 min（采集 FAM 通道的熒光信號）

五、數(shù)據處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35，則為陽性。