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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0360	應(yīng)用領(lǐng)域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè)
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴增效率、更高的擴增靈敏度、更高的擴增特異性。

戊型肝炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Hepatitis E Virus(HEV)

產(chǎn)品及特點

戊型肝炎(Hepatitis E )是一種經(jīng)糞一口傳播的急性傳染病。HEV 是單股正鏈 RNA 病毒，呈球形、直徑 27~34nm 無囊膜，核衣殼呈二十面體立體對稱。戊型肝炎病毒(HEV)為無包膜的球狀顆粒，分為 1~8 共 8 個基因型，中國內(nèi)地流行株主要為 1 型(曾稱緬甸株)，其次為 4 型。目前尚不能對 HEV 進行細(xì)胞培養(yǎng)，可實驗室感染獼猴等多種猴類，HEV 對外界環(huán)境抵抗力不強。戊型肝炎傳播途徑(主要經(jīng)糞-口途徑傳播)和臨床表現(xiàn)(隱性感染及急性肝炎，不致慢性肝炎等)與甲型肝炎相似。戊型肝炎在 15~39 歲的青年和成人高發(fā)。戊型肝炎亦為自限性疾病。HEV 對肝細(xì)胞亦無直接病變作用(CPE)。機體于病后可獲得一定的免疫力，但不夠穩(wěn)固。目前無戊型肝炎疫苗，預(yù)防戊型肝炎采用切斷糞-口傳播途徑為主的措施。本產(chǎn)品是基于染料法熒光定量 PCR 原理開發(fā)，專門檢測戊型肝炎病毒的試劑盒。它具有下列特點：

1.一站式，用于不需要單獨準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照。
2.根據(jù)戊型肝炎病毒的保守基因序列設(shè)計的引物，具有良好的特異性。
3.基于染料法qRT-PCR檢測，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。
4.使用一管式qRT-PCR技術(shù)，RT和PCR兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

戊型肝炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成份	規(guī)格
試劑一	2×qRT-PCR 緩沖液	500 μL（棕色管）
試劑二	10×qRT-PCR酶混合液	100 μL（紅蓋）
試劑三	ROX染料I	50 μL（棕色管）
試劑四	ROX染料II	50 μL（棕色管）
試劑五	熒光PCR模板稀釋液	1mL（亮黃蓋）
試劑六	戊型肝炎病毒RT-PCR引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑七	戊型肝炎病毒RT-PCR陽性對照（1×10E8拷貝/μL）	50 μL（黃蓋）
試劑八	使用手冊	1份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供RNA段作為陽性對照。

自備試劑 樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。二、樣品 RNA 的制備

6. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。

7. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）

8. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照，6 個用于 RT-PCR 陽性對照。 9. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

成分	N+2個制備所得樣品	RT-PCR陰性對照	RT-PCR陽性對照（2-7管）
2×qRT-PCR 緩沖液	10μL	10μL	各10μL
戊型肝炎病毒染料法 qRTPCR 引物混合液	2μL	2μL	各2μL
50×ROX (見注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
樣品制備所得RNA模板（來于第8步）	5.6μL	不加	不加
稀釋所得6個陽性對照（來于第6步）	不加	不加	各5.6μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…）
10×qRT-PCR 酶混合液	2μL	2μL	2μL

9. 上機后按下面參數(shù)進行 RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）。

過程	溫度	時間
RT（逆轉(zhuǎn)錄）	50℃	30 min
預(yù)變性	94℃	10 min
qPCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)）	95℃	15 sec
qPCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)）	60℃	1 min（采集 SYBR 通道的熒光信號）
按儀器預(yù)設(shè)程序進行溶解曲線分析

四、數(shù)據(jù)處理 10. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。