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人乳頭瘤病毒18染料法熒光定量PCR試劑盒

Human Papillomavirus 18(HPV-18)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一種屬于乳多空病毒科的乳 頭瘤空泡病毒 A 屬，是球形 DNA 病毒，能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖。表現(xiàn)為 尋常疣、生殖器疣（尖銳濕疣）等癥狀。 隨著性病中尖銳濕疣的發(fā)病率急速上升和宮 頸癌、肛門癌等的增多，人乳頭瘤病毒感染越來越引起人們的關(guān)注。其中黏膜高危型 HPV-16、18、30、31、33、35、39 與宮頸癌、直腸癌、口腔癌、扁桃體癌等相關(guān)， 其早期檢測非常重要。本產(chǎn)品就是針對(duì)此需求而建立的一種定量檢測 HPV-18 型病毒 的高靈敏的 PCR 檢測方法。本試劑盒具有下列特點(diǎn)：

1. 根據(jù) HPV-18 保守區(qū)設(shè)計(jì)的針對(duì) HPV-18 的 PCR 引物，專一性強(qiáng)。

2. 即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡單，定量準(zhǔn)確快速。

3. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。

4. 本試劑盒足夠 100 次 20uL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。

5. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。 

人乳頭瘤病毒18染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存(A 袋和 B 袋的試劑放樣品準(zhǔn)備區(qū)、C 袋的陽性對(duì)照分開放置)， 有效期一年。 

自備試劑   DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法）。 

使用方法 一、樣品 DNA 的制備

1. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。

二、引物的制備（在樣品制備室進(jìn)行）

2. 按引物標(biāo)簽提示在裝引物干粉的管中直接加入適量的超純水（加入量見引物試管上 的標(biāo)簽），使得兩條引物的濃度均為 10 μM（10 pmol/μL），然后各取 50 μL 混合在一起，標(biāo)注為引物混合物，放冰上待用。

三、稀釋陽性對(duì)照（以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高， 因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成 分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照， 只提供可以直接使用的長為 126bp 的 DNA 段作為陽性對(duì)照。

3. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

4. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（用帶芯槍頭，下同）。

5. 先將本試劑盒提供的陽性對(duì)照用超純水 10 倍梯度稀釋到 10E8 拷貝/μL。放冰上 待用。

6. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分 鐘，得 10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。

7. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分 震蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。

8. 換槍頭，從 6 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 10E5 拷貝/ μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。

9. 換槍頭，從 5 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 4 號(hào)管中，得 10E4 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放 冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。

三、設(shè)置 PCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 在 PCR 管中加入下列成分（待測樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次。樣品管 和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子 儲(chǔ)存好后后加）： 

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行 優(yōu)化）。 

12. 數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時(shí)， 大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時(shí)的大吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光 譜在 530 nm。

13. 根據(jù)所用熒光定量 PCR 儀器的方法進(jìn)行溶解曲線分析（每種儀器可能稍微有所不 同），排除非特異擴(kuò)增。

四、數(shù)據(jù)處理

14. 以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品 濃度的 log 和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品 DNA 的濃度。