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JC病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

John Cunningham Virus(JCV )

產(chǎn)品及特點

JC 病毒（John Cunningham Virus，JCV）屬于乳多空病毒科（Papovaviridae） 多瘤病毒屬（Orthopolyomavirus），1971 年從進行性多灶性白質(zhì)腦?。?progressive multifocal leukoencephalopathy，PML）患者的腦中分離并以該患者名字命名，普 通人群血清陽性檢測率為 40%~60%，因 AIDS 并發(fā) PML 的患者致死率約為 50%， 對于免疫力缺陷和免疫力低下的既往感染者，還會引起多瘤病毒相關(guān)性腎病 （polyomavirus-associated nephropathy，PVAN）、病毒血癥等相關(guān)疾病，并與 胃癌、肺癌、食管癌等癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，但其致病機理尚未闡明。由于目前無特異 的預防和治療方法，因此在病毒感染早期的準確檢測對疾病的診斷和治療十分關(guān)鍵，尤 其在免疫低下的人群中實現(xiàn)高效、及時的檢測至關(guān)重要。為此本公司開發(fā)了簡單 快捷的 JC 病毒染料法熒光定量 PCR 檢測試劑盒，它具有下列特點： 

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2. 根據(jù) JC 病毒保守序列設計的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應。

3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。

4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。 

JC病毒染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、制備標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。 由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭， 下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提 供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

8. 如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備 陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。

三、設置 qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果進行定量分析，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線樣品。如果做定 性分析，則 6 個標準曲線樣品只選一個做（可以選 4 號，其余樣品不變）。 以下只介紹定量分析的反應設置。

10. 在標記管中按下表加入各成分：

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同 而自行優(yōu)化）。

四、熒光定量 PCR 反應參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理

12. 設定 60℃-96℃范圍的熔解曲線分析，排除假陽性。

13. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

14. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大 于或等于 32。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該 小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 32 則為陰性，如果小 于或等于 30 則為陽性。如果在 30-32 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 32 則為陰性，如果小于 30，則為陽性。