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供貨周期	一周	規(guī)格	50T
貨號	XY-0710	應用領域	醫(yī)療衛(wèi)生,環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè)
主要用途	熒光定量PCR具有更高的擴增效率、更高的擴增靈敏度、更高的擴增特異性。

馬泰勒梨形蟲探針法熒光定量PCR試劑盒

Theileria equi

產(chǎn)品及特點

馬匹的梨形蟲病是一種由蜱傳播的感染性、非接觸性血液原蟲寄生蟲病，致病原為馬泰勒蟲（原馬巴貝斯蟲 Babesia equi）?？筛腥抉R、驢、騾及斑馬，侵犯宿主紅細胞，引起不同程度的溶血性貧血。若馬匹感染泰勒蟲后未采取相應的治療措施，感染馬匹將呈終生持續(xù)感染狀態(tài)。馬匹感染梨形蟲若呈慢性感染經(jīng)過，則很少表現(xiàn)出臨床癥狀，這也是梨形蟲病容易被忽視的重要原因。馬梨形蟲病在范圍內流行，尤以適宜蟲媒蜱生存的熱帶和亞熱帶地區(qū)為主。由梨形蟲的流行感染所引起的馬匹流產(chǎn)死亡、高額的治療費用以及對疫區(qū)馬匹運輸及參賽的限制，都對馬業(yè)造成了大的經(jīng)濟損失。因此快速靈敏檢測馬泰勒梨形蟲具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測馬泰勒梨形蟲的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)馬泰勒梨形蟲高度保守區(qū)設計，不會跟其他寄生蟲的 DNA 發(fā)生交叉反應。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

馬泰勒梨形蟲探針法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×Probe qRT-PCR MagicMix	500 μL（本色蓋）
試劑二	熒光 PCR 模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑三	馬泰勒梨形蟲探針法qPCR 引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑四	馬泰勒梨形蟲 qPCR 探針	50 μL（棕色管）
試劑五	馬泰勒梨形蟲探針法qPCR 陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)	50 μL（黃蓋）
試劑六	天凈沙核酸釋釋劑（試用裝）	20 次（1mL，綠蓋）
試劑七	使用手冊	1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7. 如果有 N 個樣品，設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

成分	樣品管 N+2 個	PCR 陰性對照管	標準曲線樣品管（2-7 管）
2×Probe qPCR MagicMix	各10 μL	10 μL	各10 μL
馬泰勒梨形蟲qPCR探針	各 1 μL	1 μL	各 2 μL
馬泰勒梨形蟲 qPCR 引物混合液	各 2 μL	2 μL	各2 μL
待測樣品 RNA 模板	6 μL
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7 號）			各6 μL （2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…）

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR：

過程	溫度	時間
預變性	95℃	5 min
PCR反應（40個循環(huán)）	95℃	0.5 min
	55℃	0.5 min（采集 FAM 通道的熒光信號）
	72℃	0.5 min

五、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35，則為陽性。