1. 什么是內(nèi)毒素？

 

　　內(nèi)毒素一種在革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的脂多糖（LPS）。它是一種典型的熱原，哪怕是皮克級(jí)（10^-12 g）或納克級(jí)的（10^-9 g）內(nèi)毒素進(jìn)入血液，也會(huì)引發(fā)各種生物反應(yīng)。因?yàn)槠溆兄蜔嵝院头€(wěn)定性，通過(guò)高壓蒸汽處理也不能*使內(nèi)毒素滅活，需在250℃或以上的溫度下，干熱處理至少半小時(shí)才能使其滅活。它存在于革蘭氏陰性菌棲息的環(huán)境中（例如水，空氣），即使在細(xì)菌死亡后，細(xì)菌性的內(nèi)毒素（LPS）仍然存在。

　　圖1為脂多糖的結(jié)構(gòu)圖，如圖所示，脂質(zhì)A在該物質(zhì)中是負(fù)責(zé)生物活性的主要部分，這部分的分子量約為2000。包含糖鏈部分在內(nèi)的整個(gè)分子的分子量一般為5000到8000左右。然而，因?yàn)閮?nèi)毒素是一種同時(shí)擁有親水區(qū)（糖鏈）和疏水區(qū)（脂質(zhì)A）的分子，它能在水溶液中相互締合，形成表觀分子量為數(shù)十至數(shù)百萬(wàn)的膠束結(jié)構(gòu)。有報(bào)告指出，膠束結(jié)構(gòu)的變化，會(huì)影響其生物活性的強(qiáng)弱。

　　圖2所示為大腸桿菌型和沙門(mén)氏菌型的脂質(zhì)A的結(jié)構(gòu)。從圖中能看出即使菌株不一樣，脂質(zhì)A的基本結(jié)構(gòu)在大體上仍然相同。

 

圖1. 脂多糖（LPS）結(jié)構(gòu)示意圖

 

圖2. 脂質(zhì)A的結(jié)構(gòu)（大腸桿菌型和沙門(mén)氏菌型）

 

 

2. 使用鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物（LAL）試劑的各種內(nèi)毒素檢測(cè)方法

 

　　由馬蹄蟹（美洲鱟）的阿米巴樣細(xì)胞溶解物制備的試劑可用于檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素。如圖3所示，在內(nèi)毒素的參與下，級(jí)聯(lián)反應(yīng)開(kāi)始進(jìn)行，其中C因子，一種絲氨酸蛋白酶前體，先被活化。隨后接下來(lái)的是B因子的活化，B因子也是一種絲氨酸蛋白酶前體和凝固酶前體，它能將凝集原水解成凝集素，形成不溶性凝膠。在LAL測(cè)試中，內(nèi)毒素可以通過(guò)三種方式定量：對(duì)凝膠的形成進(jìn)行測(cè)定，對(duì)濁度的增加進(jìn)行測(cè)定，或?qū)τ珊铣傻孜锓纸舛尫懦龅狞S色的色原體進(jìn)行測(cè)定。

　　普通的LAL試劑不僅與內(nèi)毒素反應(yīng)，而且會(huì)與（1→3）-β-D-葡聚糖（真菌細(xì)胞壁成分）反應(yīng)，因?yàn)镚因子途徑會(huì)在LAL試劑作用下被激活。為了消除這種（1→3）-β-D-葡聚糖活化，在工業(yè)中通過(guò)去除G因子或抑制其活化，開(kāi)發(fā)了各種內(nèi)毒素特異性試劑。

　　市場(chǎng)上有著各種基于圖3中的反應(yīng)機(jī)理所制得的LAL試劑以及檢測(cè)體系。因此，根據(jù)所需的準(zhǔn)確度、測(cè)試頻率、樣本數(shù)目以及其他相關(guān)因素來(lái)選擇合適的產(chǎn)品是十分重要的。 

 

圖3. LAL試劑反應(yīng)機(jī)理

 

　　美國(guó)，歐洲和日本的藥典中包含了三種內(nèi)毒素檢測(cè)方法，分別是凝膠法、比色法和比濁法，我們會(huì)在下面的章節(jié)中詳述，并且會(huì)介紹相關(guān)的LAL試劑的特點(diǎn)以及其應(yīng)用實(shí)例。

 

(1) 凝膠法

　　將樣本與LAL試劑在試管中混合，并使用干浴器，在37±1°C下，孵育60±2min，期間不要振動(dòng)。加熱完成后，立即緩慢地將試管傾斜180°。如果凝膠已形成并能保持其完整性而不變形或塌陷，則結(jié)果可確定為陽(yáng)性，而如果未形成凝膠則為陰性。在檢測(cè)期間，對(duì)于一系列樣本，要進(jìn)行多倍稀釋?zhuān)ㄍǔ?倍），以檢查每個(gè)樣品的結(jié)果是否為陽(yáng)性。確定為陽(yáng)性的大有效稀釋倍數(shù)或小濃度被稱(chēng)為終點(diǎn)。

 

 

 

相關(guān)試劑

　　在單次型試劑盒和多次型試劑盒中都包含LAL試劑，其中單次型試劑盒中的反應(yīng)小瓶包含了預(yù)分裝好的用于單次檢測(cè)的LAL試劑，而多次型試劑盒則是將所需量的已經(jīng)溶解好的LAL試劑裝入到反應(yīng)瓶中。單次型試劑盒非常適用于少量樣品的檢測(cè)，而多次型試劑盒則適用于樣本量更多的檢測(cè)。

　　多次型試劑盒的使用方法式是將0.1mL已經(jīng)溶解好的LAL試劑分裝到反應(yīng)管中，然后再加入0.1mL樣品，并將其混合。而單次型試劑盒的使用方法則是將0.2mL樣本加入到含有預(yù)先分裝好的LAL凍干試劑的反應(yīng)小瓶中。

 

ES-II系列

特異性?xún)?nèi)毒素LAL試劑（不會(huì)被（1→3）-β-D-葡聚糖活化），與細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)（BET）（日本藥典）相兼容。其膠凝靈敏度為0.015 EU/mL，單次型和多次型試劑盒均有提供。

 

（2）比色法

　　由于內(nèi)毒素會(huì)使LAL試劑活化，比色法是根據(jù)其對(duì)顯色底物的分解來(lái)檢測(cè)其活化。由于對(duì)硝基苯胺的黃色的吸光度是在405 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)的，如果樣品在約405 nm波長(zhǎng)下具有相當(dāng)大的光吸收，則不宜使用比色法。

 

相關(guān)試劑

Color KY 系列

　　內(nèi)毒素特異性比色法LAL試劑，與BET（日本藥典）一致性測(cè)試相兼容。與Toxinometer^® 結(jié)合使用的單次型試劑盒，以及與酶標(biāo)儀和Toxinometer^® 結(jié)合使用的多次型試劑盒，可用于動(dòng)態(tài)比色測(cè)試。這些系列在我們的試劑產(chǎn)品有著較高的靈敏度：檢測(cè)限為0.0002 EU/mL（單次型）和0.0005 EU/mL（多次型）。

 

（3）比濁法

　　比濁法利用凝膠濁度的變化來(lái)檢測(cè)由內(nèi)毒素誘導(dǎo)所產(chǎn)生的LAL試劑的活化。它不適用于具有一定濁度的樣品。

 

相關(guān)試劑

ES-F系列和ES-II系列

　　在動(dòng)態(tài)比濁法測(cè)量中，可以將ES-F系列、ES-II系列與酶標(biāo)儀和Toxinometer^® 結(jié)合使用。這些試劑盒不僅能獲得凝膠法的結(jié)果，同時(shí)能得到動(dòng)態(tài)比濁法的數(shù)據(jù)，測(cè)量時(shí)間為60 min。

 

 

3.對(duì)檢測(cè)用具的要求

 

　　用于內(nèi)毒素檢測(cè)的所有檢測(cè)用具必須不含內(nèi)毒素和β-葡聚糖。為使內(nèi)毒素失活，需要在250°C下干熱處理超過(guò)30 min。建議使用經(jīng)干熱滅菌的玻璃器皿。避免使用金屬工具，因?yàn)榧词褂猩倭勘幌疵摮龅慕饘匐x子（例如鐵，鋁，鎵，鉻），也可能影響測(cè)試。而當(dāng)使用一次性塑料工具（其制造商未能保證其能用于檢測(cè)用途）時(shí)，檢查它們是否滿(mǎn)足以下要求（與玻璃器皿相比）：1）未被內(nèi)毒素污染; 2）不吸附內(nèi)毒素; 3）無(wú)洗脫物。

 

 

4.內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品

 

　　根據(jù)檢測(cè)目的使用適當(dāng)類(lèi)型的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品。

•需符合BET（美國(guó)藥典/ 歐洲藥典 / 日本藥典）的檢測(cè)，例如藥品和醫(yī)療器械的產(chǎn)品終檢驗(yàn)

→必須使用美國(guó)藥典，歐洲藥典或日本藥典標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。

•對(duì)材料，工藝流程和其他相關(guān)主題的檢測(cè)

→可以使用內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）。

 

 

5. 樣本干擾

 

　　有時(shí)候需要采取預(yù)防措施，以防止樣本對(duì)內(nèi)毒素檢測(cè)有潛在影響（反應(yīng)干擾）。這些干擾分為以下兩種類(lèi)型：

 

（1）對(duì)LAL試劑的干擾

•蛋白變性劑（例如酸，堿，尿素，表面活性劑，有機(jī)溶劑）

•蛋白酶和蛋白酶抑制劑

•螯合劑（會(huì)清除反應(yīng)所需的鈣和鎂）

•對(duì)于比色法：著色物質(zhì)（在約405 nm處具有相當(dāng)大吸收的物質(zhì)）

•對(duì)于比濁法：濁度

 

（2）對(duì)內(nèi)毒素的干擾

•金屬離子（例如鐵，鋁，鎵和鉻離子。即使微摩爾級(jí)別的存在也會(huì)對(duì)測(cè)試產(chǎn)生影響）

•表面活性劑

 

　　樣本的干擾效果可以通過(guò)進(jìn)行藥典中的干擾因子測(cè)試來(lái)衡量：即通過(guò)對(duì)加標(biāo)了已知量的內(nèi)毒素的樣本進(jìn)行檢測(cè)，獲得加標(biāo)內(nèi)毒素的回收率。如果回收率在50％至200％范圍內(nèi)，則可以確定該樣本不會(huì)造成影響，換句話說(shuō)，檢測(cè)所得的內(nèi)毒素濃度是正確的。如果發(fā)現(xiàn)樣本會(huì)造成影響，可以通過(guò)對(duì)樣本溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)瑥亩鴾p少對(duì)測(cè)試的影響。然而，對(duì)樣本溶液的稀釋會(huì)提高了由原始溶液（預(yù)稀釋溶液）的濃度轉(zhuǎn)換而得的內(nèi)毒素濃度值。合理的稀釋倍數(shù)（大有效稀釋倍數(shù)），是根據(jù)待檢測(cè)的內(nèi)毒素的所需濃度以及所用LAL試劑的檢測(cè)靈敏度來(lái)確定的。欲了解反應(yīng)干擾因子和大有效稀釋度的詳細(xì)信息，詳見(jiàn)藥典中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)。

 

 

6. Limulus ES的原理（內(nèi)毒素特異性試劑）

 

圖4. 鱟試驗(yàn)反應(yīng)級(jí)聯(lián)

 

　　LAL試劑和內(nèi)毒素的級(jí)聯(lián)反應(yīng)機(jī)制如圖4所示。如果反應(yīng)體系中存在（1→3）-β-D-葡聚糖*，會(huì)激活G因子，引起伴有凝膠化的假陽(yáng)性反應(yīng)。在這種情況下，無(wú)論體系中是否存在內(nèi)毒素，都會(huì)發(fā)生反應(yīng)，意味著無(wú)法對(duì)內(nèi)毒素進(jìn)行特異性檢測(cè)。為此，我們研發(fā)出Wako's Limulus ES，該產(chǎn)品通過(guò)在反應(yīng)體系中加入過(guò)量共存的（1→3）-β-D-葡聚糖（羧甲基化凝膠多糖），從而來(lái)抑制（1→3）-β-D-葡聚糖的干擾。因此，β-葡聚糖對(duì)LAL試劑的活化受到抑制，從而使內(nèi)毒素特異性檢測(cè)能夠進(jìn)行。過(guò)量的β-葡聚糖可以抑制其自身反應(yīng)的原理如圖5所示：β-葡聚糖和LAL試劑之間反應(yīng)的濃度范圍對(duì)于整個(gè)反應(yīng)而言很窄。另一方面，內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)在很寬的濃度范圍內(nèi)都會(huì)發(fā)生，并且不受大量共存的β-葡聚糖的任何干擾。Wako的Limulus ES就是根據(jù)這個(gè)原理而制作的（見(jiàn)圖6）。

*（1→3）-β-D-葡聚糖來(lái)源于霉菌（真菌）或經(jīng)纖維素濾膜過(guò)濾所得。

 

圖5. 羧甲基化凝膠多糖和LAL反應(yīng)

使用Toxinometer^®（檢測(cè)時(shí)間設(shè)定為99 min）和Limulus HS進(jìn)行檢測(cè)。

○在99 min內(nèi)檢測(cè)不到凝膠的生成

●有凝膠的生成

 

 

圖6. 羧甲基化凝膠多糖對(duì)使用Limulus HS和Limulus ES進(jìn)行的內(nèi)毒素檢測(cè)的影響

A：Limulus HS

B：Limulus ES

○內(nèi)毒素的系列稀釋

▲含有1 μg/mL羧甲基化凝膠多糖的內(nèi)毒素系列稀釋

 

 

◆產(chǎn)品列表

 

產(chǎn)品編號(hào)	產(chǎn)品名稱(chēng)	規(guī)格	包裝
295-72301	Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F SINGLE TEST SENSITIVITY 0.015 EU/mL (25 LAL）	for Endotoxin Detection	25 tests
291-75701	Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F MULTI TEST (without CSE)	for Endotoxin Detection	100 tests
295-51301	Limulus ES- II Single Test wako 鱟試劑ES- II Single（適用于溶膠凝膠法和動(dòng)態(tài)比濁法）	for Endotoxin Detection	25 tests
299-51201	Limulus ES- II Test wako 鱟試劑ES- II （適用于溶膠凝膠法和動(dòng)態(tài)比濁法）	for Endotoxin Detection	60 tests
292-51213	Limulus Amebocyte Lysate ES-II，Lyophilized 鱟試劑LAL ES-II（適用于溶膠凝膠法和動(dòng)態(tài)比濁法）	for Endotoxin Detection	2 mL×5
293-75401	Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F/Plate (with CSE)	for Endotoxin Detection	160 tests
297-75301	Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F/Plate (without CSE)	for Endotoxin Detection	200 tests
291-53601	Limulus Color KY Single Test wako	for Endotoxin Detection	25 tests
291-53101	Limulus Color KY Test Wako	for Endotoxin Detection	60 tests
290-33771	Toxinometer® ET-6000/J Standard Set 內(nèi)毒素檢測(cè)儀ET-6000/J	—	1 set