富士膠片和光純藥株式會(huì)社 生命科學(xué)研究所 福地大樹

 

 

◆前言

 

      包含疫苗在內(nèi)的大部分生物藥都是使用培養(yǎng)細(xì)胞或大腸桿菌生產(chǎn)的，有研究者指出，通過這種方式生產(chǎn)的原料藥、制劑可能會(huì)殘留著宿主細(xì)胞來源的DNA。不可否認(rèn)，宿主細(xì)胞或病毒來源的致癌基因很可能會(huì)通過這些殘留DNA轉(zhuǎn)運(yùn)過來，或引起病毒DNA感染事件。因此，殘留DNA的定量檢測(cè)是生物制藥和其工藝驗(yàn)證中*的一部分。

      有報(bào)告建議生物藥中每劑量殘留DNA的含量不超過100 pg^[1] ，不僅是歐美地區(qū)，其他國家也愈發(fā)認(rèn)為必須將定量檢測(cè)宿主細(xì)胞來源的殘留DNA作為質(zhì)量檢測(cè)項(xiàng)目之一。而檢測(cè)這種痕量殘留DNA，則需要從樣品中以高回收率提取痕量殘留DNA。

      本文將介紹本公司銷售的DNA Extractor^® Kit —— 一款可用于此類痕量殘留DNA檢測(cè)的DNA提取試劑盒。

 

 

◆關(guān)于DNA Extractor^® Kit

 

      若要檢測(cè)、定量生物藥中所含的DNA總量，必須先將其所含的DNA從蛋白質(zhì)等其他活性成分中分離、純化出來。傳統(tǒng)上分離DNA時(shí)通常會(huì)采用蛋白酶消化樣品，然后利用苯酚、三氯甲烷將DNA提取出來的方法。然而，這種方法卻有著這些缺點(diǎn)：在獲得相對(duì)高純度的DNA的同時(shí)，需要使用苯酚、三氯甲烷等有害物質(zhì)；并且需要花費(fèi)工夫和時(shí)間進(jìn)行提取操作。而使用二氧化硅等物質(zhì)作為載體的固相提取方法會(huì)因?yàn)镈NA被吸附到載體上而導(dǎo)致其損耗，因此并不適合用于回收痕量DNA。同樣的，使用有機(jī)溶劑的方法的痕量DNA回收率也很低，這也是DNA提取試劑的問題之一。

      本公司1992年起推出的DNA Extractor^® Kit（中國藥典版本產(chǎn)品編號(hào)：292-81101），通過使用NaI法解決了以上問題，只需簡易的操作，便可以高回收率提取高純度的DNA。

 

 

◆DNA Extractor^® Kit的原理

 

      本試劑盒 中包含NaI和表面活性劑，NaI作為蛋白質(zhì)增溶劑（離液離子），與表面活性劑一同將樣品中以蛋白質(zhì)為主的成分轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇軤顟B(tài)，然后通過加入異丙醇，能夠選擇性地令核酸（主要是DNA）和糖原產(chǎn)生沉淀（即共沉淀）^[2]。如上所述，該試劑盒實(shí)現(xiàn)了在不使用固相載體或有機(jī)溶劑的情況下，通過簡化的提純步驟獲得了沉淀物，以高回收率提取痕量DNA。

※ 本試劑盒組分：NaI溶液、N-月桂酰肌氨酸鈉溶液、洗凈液（A）、洗凈液（B）、糖原溶液

 

 

◆使用DNA Extractor^® Kit提取DNA與定量DNA總量案例

 

      筆者將在下文中重新介紹一次曾刊載于本公司和光純藥時(shí)報(bào)Vol.60 No,3 p.28（1992）中的案例，該案例報(bào)道了關(guān)于本試劑盒在存在賦形劑以及添加劑的情況下的DNA加標(biāo)回收率。在該實(shí)驗(yàn)中，分別將通常用作賦形劑或添加劑的物質(zhì)（精氨酸、尿素等）和蛋白質(zhì)（BSA（牛血清白蛋白）和人γ球蛋白）以常量或過量溶解于磷酸鹽緩沖液中，然后添加pg級(jí)的小牛胸腺DNA從而得到模型溶液。

      接下來，按照DNA Extractor^® Kit的實(shí)驗(yàn)步驟，對(duì)400 µL的每種模型溶液進(jìn)行DNA提取處理。將所得沉淀物溶解于500 μL的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行閾值法總DNA定量^※[3][4]，測(cè)定其DNA的加標(biāo)回收率。測(cè)定結(jié)果如表1所示。

 

賦形劑及其含量		DNA添加量（pg）	DNA回收率（%）
山梨糖醇	200 mg/mL	50	95
	50 mg/mL	50	94
麥芽糖	400 mg/mL	50	89
	200 mg/mL	50	102
	50 mg/mL	50	98
甘露醇	200 mg/mL	50	84
葡萄糖	200 mg/mL	50	81
蔗糖	200 mg/mL	50	92
尿素	1 mol/L	50	106
精氨酸	200 mg/mL	50	110
γ球蛋白	60 mg/mL	10	102
	60 mg/mL	5	84
	60 mg/mL	2.5	88
BSA	200 mg/mL	10	95

 

表1. 在存在賦形劑以及添加劑的情況下的DNA加標(biāo)回收率

 

      我們對(duì)5種糖類的不同濃度下的DNA回收率進(jìn)行了測(cè)定，所有DNA加標(biāo)回收率都在80%~110%范圍內(nèi)。另外，在精氨酸和尿素中也能夠以高回收率提取DNA。在蛋白質(zhì)方面，我們測(cè)定了BSA（牛血清白蛋白）和人γ球蛋白，發(fā)現(xiàn)兩者的DNA回收率都很高。根據(jù)樣品不同（如蛋白質(zhì)種類），可能會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)沉淀的情況，這種情況下只需稀釋或使用蛋白酶處理即可^[5]。從以上結(jié)果來看，本試劑盒可對(duì)廣泛樣品以高重復(fù)性和高回收率提取殘留DNA。

※“閾值法總DNA定量”是指利用Molecular Devices公司的“Threshold^® Total DNA assay system”進(jìn)行的DNA總量定量的測(cè)定方法，是一種不依賴于序列的DNA定量測(cè)定方法。

      該方法的總DNA檢測(cè)靈敏度為2 pg/assay。

 

 

◆使用DNA Extractor^® Kit提取痕量殘留DNA與通過qPCR法進(jìn)行定量的案例

 

      如上所述，“Threshold^® Total DNA assay system”是一種總DNA定量法，并不針對(duì)特定序列進(jìn)行檢測(cè)。如果希望檢測(cè)出宿主細(xì)胞來源的殘留DNA，可以利用qPCR法將特定序列作為檢測(cè)對(duì)象。相對(duì)于閾值法的DNA定量，qPCR法有著能更高靈敏度檢測(cè)殘留DNA的這一優(yōu)點(diǎn)，接下來我們將圍繞其能否提取假定宿主細(xì)胞來源的痕量DNA進(jìn)行探討。

      在本實(shí)驗(yàn)案例中，我們將常用于蛋白和抗體生產(chǎn)的CHO細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞系細(xì)胞）以及大腸桿菌的基因組DNA作為殘留DNA模型，通過提取痕量殘留DNA以及以qPCR對(duì)其進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)步驟如圖1所示。

 

 

圖1. 實(shí)驗(yàn)步驟

 

 

      首先，在100 μL的水（注射用蒸餾水）中添加了0.1 pg～100 pg各基因組DNA的樣品，使用本公司的DNA提取試劑盒對(duì)上述樣品提取DNA，然后將提取的DNA溶解于100 μL的水中。之后采用qPCR，并根據(jù)同時(shí)值得的校準(zhǔn)曲線計(jì)算出添加DNA的回收量。結(jié)果，大腸桿菌基因組和CHO細(xì)胞基因組在0.1 pg～100 pg之間的加標(biāo)回收率為85～120%（雖未在文中展示數(shù)據(jù)，但兩種基因組在1000 pg以內(nèi)回收率幾乎為100%）。

      接下來，進(jìn)行模擬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含有殘留DNA的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品通過將0.1 pg CHO細(xì)胞基因組DNA添加到500 μL在10％FBS DMEM中培養(yǎng)3天的人胰腺癌細(xì)胞系Panc-1的培養(yǎng)上清液中配制而成。結(jié)果，根據(jù)生成的校準(zhǔn)曲線所得的回收量為0.093 pg。通過上述實(shí)驗(yàn)證明，使用本試劑盒，即使是500 μL中所含殘留DNA僅為0.1 pg（100 fg）的fg級(jí)別的痕量DNA也以高回收率進(jìn)行提取。另外，由于DNA Extractor^® Kit可以以90%以上的高回收率回收存在于水、磷酸鹽緩沖液或是細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣品中的痕量殘留DNA（表1表2），因此可以證明本試劑盒的高回收率在不同樣品中具有廣泛性。

 

樣品 （括號(hào)為所添加基因組DNA來源 ）	DNA量	根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得回收DNA量（pg）	加標(biāo)回收率（%）
注射用蒸餾水 （大腸桿菌）	0.1 pg	ND（低于檢測(cè)下限）	－
	1 pg	1.031	103
	10 pg	11.09	111
	100 pg	85.1	85
注射用蒸餾水 （CHO細(xì)胞）	0.1 pg	0.933	93
	0.1 pg	1.187	119
	10 pg	11.57	116
	100 pg	87.1	87
人類細(xì)胞培養(yǎng)上清液 （CHO細(xì)胞）	0.1 pg	0.0928	93

 

表2. 基因組DNA加標(biāo)回收率

 

 

◆結(jié)語

 

      使用DNA Extractor^® Kit，能夠以高回收率回收樣品中所含殘留DNA。在定量殘留DNA時(shí)，從樣品中提取DNA是十分重要的一個(gè)步驟，即便是痕量殘留DNA也可以通過本試劑盒進(jìn)行高回收率提取。另外，由于本試劑盒能夠用于廣泛的樣品，因此我們認(rèn)為它不僅能用于CHO細(xì)胞，還能用于大腸桿菌和酵母等其他宿主細(xì)胞來源的殘留DNA，有望在生物制藥的質(zhì)控中發(fā)揮作用。

 

 

◆參考文獻(xiàn)

 

1. Knezevic et al. : Biologicals, 36:203-211(2008).

2. Ishizawa, M et al. : Nucleic Acids Res., 19, 5792(1991).

3. Kung. V. T et al. : Anal. Biochem., 187, 220-227(1990).

4. 水沢左衛(wèi)子, 本間玲子. : Pharm Tech. Japan, 7, 309-314, 426-431(1991).

5. 和光純薬時(shí)報(bào) Vol.61 p.27(1993)

 

 

◆產(chǎn)品列表

 

產(chǎn)品編號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
292-81101	DNA Extractor™ Kit for Residual DNA, CP Method  (Sodium Iodide Method) 殘留DNA提取試劑盒（NaI法）	50 tests