GenomONE ^®

仙臺病毒包膜細胞融合試劑

　　GenomONE^®-CF EX含有仙臺病毒包膜和緩沖液，可促使細胞融合。適用于貼壁或者懸浮狀態(tài)的任何細胞。僅僅需要30分鐘就可完成融合細胞及制造混合動力的操作。

◆用途

●腫瘤疫苗·癌癥免疫研究

●癌細胞和樹突細胞融合等

●再生醫(yī)療·細胞治療研究

●臟器來源細胞和干細胞融合等

●單克隆抗體的制備

●抗原B細胞和髓過氧化物酶細胞融合

●分生·分化·育種研究

●對脫核未受精卵的核移植（核置換）

●其他

●PEG&電融合的使用介紹

◆HVJ Envelope（HVJ-E）：

　　HVJ包膜是*滅活和純化仙臺病毒（HVJ*），即只留下細胞膜融合能力的衣殼蛋白包膜。仙臺病毒的HN蛋白可與細胞膜外的唾液酸受體結(jié)合，通過F蛋白的作用，引起細胞膜融合。在HVJ-E中，仙臺病毒的基因組RNA已經(jīng)*失活，在人類和實驗動物體內(nèi)不存在感染或增殖。因而不需要特殊的操作和設(shè)備，它可以安全地在普通的實驗室使用。

*HVJ：日本仙臺病毒

◆HVJ-E細胞融合原理

在低溫（0 - 8℃)條件下，每一個細胞與數(shù)百個以上的HVJ - E接觸，HVJ - E與細胞膜上的唾液酸受體結(jié)合，通過細胞表面吸附（步驟1），細胞通過HVJ-E相互連接（步驟2），形成細胞彼此聚集的狀態(tài)。當該細胞/ HVJ-E的復(fù)合物加熱到37℃時，細胞膜干擾就會進一步擴大，細胞膜內(nèi)膜結(jié)構(gòu)也暫時改變。這種變化是短暫的，隨后會立即返回到正常結(jié)構(gòu)，但是在這個期間，細胞膜利用強疏水性結(jié)合力進行相互融合（步驟3）。

◆應(yīng)用方法

◆懸浮細胞融合案例

同種細胞融合

異種細胞融合

　　熒光標記的紅（* 1）細胞和綠色熒光標記（* 2）細胞（每1.0×10⁵個）在融合緩沖液50 μL混合后，加入HVJ-E冰敷5分鐘，隨后37℃下反應(yīng)15分鐘后，融合細胞（黃色）進行了觀察。

◆黏著態(tài)和懸浮態(tài)細胞融合案例

在粘合狀態(tài)BHK-21（紅）和在浮動狀態(tài)（綠色）的P19細胞的融合

膠粘狀態(tài)的HeLa S3（紅）在浮動狀態(tài)（綠色）的P19細胞的融合

　　熒光標記的（* 1）中的紅，附著的細胞在12孔平板，綠色熒光標記（* 2）中，添加預(yù)先準備的HVJ-E，來處理漂浮細胞1×10⁵個的懸浮液（融合緩沖污染），并在室溫下離心（1000轉(zhuǎn)），每個板5分鐘。隨后孵育37℃15分鐘后，更換增殖用的培養(yǎng)基繼續(xù)細胞培養(yǎng)。觀察3個小時后的融合細胞（黃色）。

◆和PEG法的比較

　　紅色熒光標志(* 1）的ratMSC（骨髓由來老鼠間葉系細胞）和綠色熒光標識的老鼠原代培養(yǎng)心肌細胞2×10⁵個融合緩沖液50　μL中混合后，添加HVJ – E，冰浴5分鐘，然后37℃孵育反應(yīng)15分鐘，觀察融合細胞（黃色）。1 - 2日培養(yǎng)后，觀察到粘著的融合細胞。在PEG法中融合緊接之后細胞毒性強烈，融合細胞的數(shù)量很少。

◆安全性說明

HVJ-E失活的確認（確認無感染性病毒的存在）

GenomONE ^®

仙臺病毒包膜細胞融合試劑

Q&A

Q1：什么是GenomONE^®-CF EX？
A1：GenomONE^®-CF EX是由HVJ包膜（HVJ-E）和特殊緩沖液組成的細胞融合試劑盒。 它可以用于貼壁細胞和懸浮細胞。 使用該試劑盒融合相同或不同類型的細胞只需30分鐘。

Q2：HVJ-E的特性？
A2：HVJ包膜是通過*滅活的仙臺病毒（HVJ：日本血凝素病毒）純化后的產(chǎn)物。 它是一種囊泡，其中僅保留仙臺病毒具有細胞膜融合能力的包膜蛋白。 *，在鞘膜外耳炎（包膜）仙臺病毒中的HN蛋白能識別細胞膜上的受體（在糖鏈的末端具有唾液酸）并且將其吸收，從而通過F蛋白（包膜的另一組分）介導(dǎo)膜融合。 HVJ-E中包含的仙臺病毒基因組RNA已經(jīng)*滅活，并且在人或?qū)嶒瀯游镏屑炔荒芨腥疽矝]有增殖潛力。HVJ-E可以在普通實驗室中安全使用，無需任何特殊操作或設(shè)施。

Q3：失效日期？
A3：在鋁紙包裝上印刷了凍干的HVJ-E的保質(zhì)期。

Q4：對于HVJ滅活方法？
A4：雖然HVJ-E使用HVJ（仙臺病毒/鼠副流感病毒1）作為原料，但HVJ的基因組RNA已經(jīng)通過藥物治療而*滅

活*。 HVJ-E不會在人或動物中增殖或表現(xiàn)出致病作用。
A4：參考文獻：Prior, P. et al.: BioPharm, 22-33 (Oct. 1996) Kaneda, Y. et al.: Advances in Genetics, 53, 308-332 (2005).

Q5：病毒滅活的評估和確認？
A5：通過對培養(yǎng)的細胞和生長的雞蛋進行病毒增殖性電位排除試驗，證實了每批的HVJ已經(jīng)失活。

Q6：確認病毒滅活的方法？
A6：通過以下三種方法證實了在人或?qū)嶒瀯游镏腥狈VJ-E的感染或增殖的可能性。
A6：（1）使用培養(yǎng)細胞的測定
A6：（2）使用受精的雞蛋進行測定
A6：（3）使用小鼠進行測定

Q7：實驗室生物實驗安全級別，使用注意事項？
A7：GenomONE^® 可以在普通實驗室安全使用。雖然HVJ-E使用HVJ（仙臺病毒/鼠副流感病毒1）作為原料，但HVJ的基因組RNA已經(jīng)通過藥物治療而*滅活。 HVJ-E不會在人或動物中增殖或表現(xiàn)出致病作用。然而，當使用該產(chǎn)品進行細胞融合實驗時，產(chǎn)生的重組生物體等可能屬于卡塔赫納生物安全議定書的限制。

A７：使用本產(chǎn)品生產(chǎn)重組生物體的實驗者必須采取適當措施，防止此類生物體擴散，然后再使用本產(chǎn)品進行實驗。
A７：此外， DNA重組實驗，必須遵循重組DNA實驗規(guī)則（在使用國的相關(guān)法規(guī)中規(guī)定或由相關(guān)設(shè)施的安全委員會規(guī)定），并且實驗只能在具有合適設(shè)施的實驗室中進行DNA重組實驗。

Q8：質(zhì)量保證？
A8：
A8：◆通過對培養(yǎng)細胞和受精雞蛋的病毒增殖性電位排除試驗，確認每批HVJ的滅活。
A8：◆無菌檢測證實了不存在細菌和真菌污染。
A8：◆內(nèi)毒素水平已被證實小于2.5 EU / mL（鱟細胞裂解物凝膠凝塊測定）。

Q9：許可證要求和商業(yè)用途？
A9：本產(chǎn)品由一個或多個權(quán)利要求所覆蓋，并且僅授予研究用途。 未經(jīng)制造商事先書面許可，不得用于任何商業(yè)或其他目的，或在修改后轉(zhuǎn)售等(Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd.)。

Q10：每種試劑的作用？
A10：
A10：◆凍干的HVJ-E：HVJ-E是通過*滅活HVJ（仙臺病毒）制備的純化囊泡，其中僅保留HVJ具有細胞膜融合能力的包膜蛋白。
A10：◆HVJ-E懸浮緩沖液：用于復(fù)融，重懸，稀釋HVJ-E或其他目的的生理濃度的中性緩沖液。
A10：◆細胞融合緩沖液：用于細胞融合的優(yōu)化緩沖液。
A10：◆　“細胞融合緩沖液（20X濃縮物）”應(yīng)在使用前用無菌純水（例如，不含內(nèi)毒素的注射用水）以1：20稀釋。

Q11：每種試劑的成分和濃度？
A11：無相關(guān)數(shù)據(jù)

Q12：重組HVJ-E懸浮液的儲存？
A12：
A12：◆為了連續(xù)使用，請在冰箱（2-8°C）存放多兩個星期。
A12：◆對于長期儲存，根據(jù)每次使用量將試劑分裝保存在-80℃下冷凍多3個月。 冷凍后只能解凍一次。

Q13：“HVJ-E懸浮緩沖液”和“細胞融合緩沖液（20X）”的保存？
A13：儲存在冰箱（2-8°C）。 不要凍結(jié)。

Q14：HVJ-E的粒度？
A14：約300nm（200-400nm）

Q15：HVJ-E顆粒數(shù)？
A15：40mL復(fù)融的HVJ-E懸浮液包括約109-1010個HVJ-E顆粒。

Q16：HVJ-E的血細胞凝集單位（HAU）？
A16：40mL復(fù)融的HVJ-E懸浮液，相當于約1,000-2,000個血凝單位（HAU）。

Q17：使用頻率？
A17：
A17：◆對于相同或不同類型的細胞的融合：約100次
A17：◆用于制備B細胞雜交瘤：約10次