化工儀器網(wǎng)
詳細(xì)介紹
SuperSep Phos-tag™ 預(yù)制膠
SuperSep Phos-tag™ 是研究蛋白磷酸化的方法，無需特異性磷酸化抗體或者同位素標(biāo)記。
◆SuperSep Phos-tag™
Phos-tag™ 是一種預(yù)制膠，預(yù)先加入了50 μmol/L的Phostag™ Acrylamide，打開包裝即可直接使用。預(yù)制膠中含有鋅作為金屬離子，在中心凝膠緩沖液中保存穩(wěn)定性很好，得到的帶條結(jié)果也很整齊。
磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作為不同條帶分離。
分離后，膠可用于考馬斯亮藍(lán)染色，免疫印跡和質(zhì)譜實驗。
◆Phos-tag™ SDS-PAGE的原理
◆在HighWire Search 上搜索到的論文數(shù)
◆運用
利用p35的丙氨酸突變體確定Cdk5 激活p35的磷酸化位點
p35常見的磷酸化位點是Ser8和Thr138。但是Ser8和Thr138位點往往會發(fā)生丙氨酸突變，產(chǎn)生3種突變體（Ser8突變體：S8A，Thr138突變體：T138A，Ser8和Thr138雙突變體：2A）。這3種突變體、野生型p35、Cdk5和沒有激酶活性的Cdk5都來源于COS-7細(xì)胞。這些細(xì)胞裂解液用Phos-tag™ SDS-PAGE和Western blotting 進行檢測（檢測抗體：p35抗體）。
100 μM Phos-tag ™ 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝膠
可明確磷酸化位點和條帶遷移率的關(guān)系！
- 泳道1（條帶L2和L4）和泳道5（條帶M1）：p35在Cdk5的作用下發(fā)生了磷酸化；
- 泳道1（條帶L2和L4）和泳道3（條帶L2和L4）：在無激酶活性Cdk5的作用下，大約有一半p35蛋白在Thr138位點
發(fā)生磷酸化，同樣在138位發(fā)生突變的p35蛋白亦是如此。
- 泳道5 （條帶M1）和泳道6（條帶L3和L4）：Ser8和Thr138是主要的磷酸化位點；
- 泳道5（條帶M1）、泳道7（條帶L1和L2）和泳道8（條帶M2）：條帶M1是Ser8和Thr138都發(fā)生磷酸化的條帶；
條帶M2是只有Ser8磷酸化的條帶；條帶L1和L2是只有Thr138磷酸化的條帶。
※ 條帶L1和L3中的X 是不確定哪個位點發(fā)生磷酸化的條帶；
※ 條帶L4是非磷酸化的p35。
【結(jié)果提供】
理化學(xué)研究所 腦科學(xué)綜合研究中心 回路功能研究核心 記憶功能研究團隊 細(xì)川智永（Dr. T. Hosokawa）
首都大學(xué)東京 理工學(xué)研究科 生命科學(xué)專業(yè) 神經(jīng)分子功能研究室 久永真市（Dr. S. Hisanaga）
檢測含有Dnmt1磷酸化激酶的片段
我們可以確定在片段中含有目的激酶！
① 采用親和色譜法從鼠腦提取液中純化GST-Dnmt1（1-290）結(jié)合蛋白
② 使用0.3 M 和1 M NaCl 的DNA 纖維素柱洗脫得到目的蛋白
③ GST-Dnmt1（1-290）作為體外激酶實驗的反應(yīng)底物
④ Phos-tag ™ SDS-PAGE 用于Western blotting，確定遷移條帶中每個片段的激酶活性
【結(jié)果提供】
高知大學(xué) 綜合研究中心 生命、功能物質(zhì)部門 實驗實習(xí)機器設(shè)施 杉山康憲（Dr. Y. Sugiyama）
香川大學(xué) 農(nóng)學(xué)部 應(yīng)用生物科學(xué)科 動物功能生化學(xué)研究室 龜下勇（Dr. I. Kameshita）
二維電泳中的應(yīng)用：分析hnRNP K磷酸化異構(gòu)體
小鼠巨噬細(xì)胞J774.1 經(jīng)LPS 刺激后，裂解細(xì)胞，經(jīng)過免疫沉淀法分離得到hnRNP K。在二維電泳中，一維是IPG 膠，二維是Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分離hnRNP K 的異構(gòu)體。利用質(zhì)譜儀，可以確認(rèn)不同的點代表不同的亞型或修飾蛋白。
同一個等電點的位置上，不同位點發(fā)生磷酸化都可以被區(qū)分開來
（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）
【結(jié)果提供】
橫濱市立大學(xué) 生命納米系統(tǒng)科學(xué)研究科 生物體超分子系統(tǒng)科學(xué)專業(yè) 木村彌生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）
理化學(xué)研究所RCAI 小原收
◆備注
樣品制備：
Phos-tag SDS-PAGE對于蛋白樣品中的雜質(zhì)非常敏感，尤其是螯合劑，釩酸，無機鹽，表面活性劑這類物質(zhì)。
強烈建議在Phos-tag SDS-PAGE之前通過TCA沉淀或滲析法降低雜質(zhì)含量。
轉(zhuǎn)膜前處理：
另一個必須的步驟是在轉(zhuǎn)膜前，用EDTA去除凝膠中的金屬離子（Mn2+ 或者Zn2+）；
該步驟可提高蛋白的轉(zhuǎn)膜效率。
● 分別準(zhǔn)備10 mmol/L 含EDTA和不含EDTA 兩種1x transfer buffer。
● 將凝膠浸泡在含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer，至少20分鐘，溫和搖晃。更換新緩沖液，重復(fù)3次。
● 將凝膠浸泡在不含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer，10分鐘，溫和搖晃。
● 轉(zhuǎn)膜操作*。
* 建議用濕法轉(zhuǎn)膜，以提高轉(zhuǎn)膜效率。
◆質(zhì)量控制
每一批SuperSep Phos-tag™，出廠前均根據(jù)其產(chǎn)品規(guī)格進行測試，以保證可分離磷酸化和非磷酸化蛋白，以及他們的分離成都在正常參數(shù)內(nèi)。
◆保存溫度
2-10℃
◆產(chǎn)品信息
用于Bio-Rad伯樂電泳儀
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 電泳儀 | 規(guī)格 |
198-17981 | Phos-tag™ 預(yù)制膠50μmol/l，7.5%，17孔，BioRad型 | Mini-PROTEAN® Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories, Inc.) | 5 塊 |
195-17991 | Phos-tag™ 預(yù)制膠50μmol/l，12.5%，17孔，BioRad型 | 5 塊 |
用于Life Technologies電泳儀
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 電泳儀 | 規(guī)格 |
192-18001 | Phos-tag™ 預(yù)制膠50μmol/l，7.5%，17孔，Life Technologies型 | XCell SureLock® Mini-Cell (Life Technologies, Inc.)
| 5 塊 |
199-18011 | Phos-tag™ 預(yù)制膠50μmol/l，12.5%，17孔，Life Technologies型 | 5 塊 |
用于Wako EasySeperator電泳儀
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 凝膠濃度 | 孔數(shù) | 包裝 |
| 192-17401 | Phos-tag™ 預(yù)制膠50 μmol/L | 6.0% | 13孔 | 5塊 |
| 199-17391 | 6.0% | 17孔 | 5塊 | |
| 195-17371 | 7.5% | 13孔 | 5塊 | |
| 192-17381 | 7.5% | 17孔 | 5塊 | |
| 193-16711 | 10.0% | 13孔 | 5塊 | |
| 190-16721 | 10.0% | 17孔 | 5塊 | |
| 195-16391 | 12.5% | 13孔 | 5塊 | |
| 193-16571 | 12.5% | 17孔 | 5塊 | |
| 193-16691 | 15.0% | 13孔 | 5塊 | |
| 196-16701 | 15.0% | 17孔 | 5塊 | |
| 197-16851 | 17.5% | 13孔 | 5塊 | |
| 194-16861 | 17.5% | 17孔 | 5塊 |
◆相關(guān)產(chǎn)品
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
| 058-07681 | Phos-tag預(yù)制凝膠的配套電泳槽 | 1 set |
SuperSep Phos-tag™ 預(yù)制膠