非洲豬瘟快速檢測設(shè)備價格PCR儀廠家

非洲豬瘟快速檢測實驗室方案

用于非洲豬瘟病毒檢測的實驗室，推薦配置以下設(shè)備：II級生物安全柜、高速離心機、低溫冰箱、高壓蒸汽滅菌器、恒溫水浴鍋、組織勻漿儀、移液器、PCR儀、迷你型離心機。同時，建議實驗室配備合適的個人防護用品，如防護服、手套、口罩等。

非洲豬瘟快速檢測實驗步驟：
1.樣品處理
血液樣品直接用；
淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體樣品，用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品2.0 g于研缽中充分研磨，再加10.0 mL PBS（pH 7.2，含1萬單位青霉素和1萬單位鏈霉素）混勻（樣品不足2.0 g按1:5比例加PBS），對處理的待檢樣品置70℃，30 min滅活后，3 000 r/min，4 ℃離心5 min，取上清液，編號備用；血球粉處理同上，只不過省掉研磨步驟。

2.豬瘟檢測樣品存放
采集或處理好的樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過24 h；若需長期保存，須放置-80 ℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。
3.非洲豬瘟快速檢測操作步驟
3.1 病毒DNA的提?。ㄊ褂肁盒）
（1）待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數(shù)總和用n表示，取n個滅菌的1.5 mL離心管，逐管編號。
（2）每管加入Buffer A 500 L。
（3）每管分別加入已處理的待檢樣品、陽性對照、陰性對照各200 L，充分混勻，室溫放置10分鐘。
（4）取與上述離心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管，編號。將離心管中的溶液轉(zhuǎn)移至DNase-Free吸附柱，（為避免堵塞吸附柱，盡量不要吸懸浮雜質(zhì)）。
（5）13000 r/min室溫離心30 sec。
（6）棄去收集管液體，將吸附柱放回收集管中。
（7）吸附柱內(nèi)加入600 μL Buffer B，13000 r/min離心30 sec。
（8）棄去收集管液體，將吸附柱放回收集管中。
（9）重復(fù)步驟（7），（8）。
（10）13000 r/min空柱離心2 min，去除殘留液。
（11）將每個吸附柱分別移入新的1.5mL離心管中，向柱*加入50 μL Buffer C，室溫靜置1 min，13000 r/min離心30 sec，離心管中液體即為模板DNA。獲得的DNA溶液，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁馓崛〉腄NA須在2 h內(nèi)進行PCR 擴增，若需長期保存須放置-80 ℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融）。
3.2 非洲豬瘟快速檢測用熒光PCR擴增（使用B盒）
（1）從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液、Taq酶，室溫融化后，2 000 r/min離心5 sec。設(shè)所需PCR管數(shù)為n（n = 樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系需要20 μL 熒光PCR反應(yīng)液和0.5 μL Taq酶。計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積小管中，充分混合均勻后，向每個PCR管中各分裝20 μL。
（2）分別向上述PCR管中加入1.3.1（11）中制備的DNA溶液各5μL，蓋緊管蓋，500 r/min 離心30 sec。
（3）將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，作好標記。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：
*階段，預(yù)變性95℃/3 min；第二階段，95℃/15 sec，52℃/10 sec，60℃/35 sec共45個循環(huán)。熒光收集在第二階段每次循環(huán)的60℃延伸時進行。

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