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在生物制藥領(lǐng)域，抗體藥物的生產(chǎn)過程通常是一個復(fù)雜而多階段的流程，包括從細胞培養(yǎng)到最終分析的多個步驟。在這一過程中，不僅要選擇合適的細胞株以及優(yōu)化培養(yǎng)條件，最大限度抑制聚集體形成；同時由于糖鏈的不同導(dǎo)致抗體活性差異，還要進行監(jiān)測及優(yōu)化，以確保最終產(chǎn)品的純度和生物活性。而這些流程往往需耗費大量人力和時間。

除此之外，聚集體分析常采用尺寸排阻色譜法（SEC），在分析前需要對目標(biāo)蛋白質(zhì)進行純化前處理，這進一步增加了分析的復(fù)雜性。基于對質(zhì)量評估的嚴(yán)苛要求，研發(fā)一個能夠無縫對抗體進行糖鏈及聚集體評估的自動化分析系統(tǒng)顯得尤為必要。

針對這一挑戰(zhàn)，島津推出生物惰性超高效液相Nexera XS inert和液體處理器 LH-40的組合，為實現(xiàn)抗體藥物中糖鏈及聚集體分析的自動化提供參考，詳情如下：

1預(yù)處理（粗純化）

樣品使用培養(yǎng)天數(shù)不同的抗體培養(yǎng)上清液（第4，7，12天），在粗純化之后進行糖鏈分析及聚集體分析。

將第4，7，12天培養(yǎng)上清液分別取500μL，在下表條件下進行純化。由于進樣量相同，通過比較5.7min附近IgG抗體的峰面積值估計產(chǎn)量，結(jié)果顯示培養(yǎng)天數(shù)越多，IgG抗體的產(chǎn)量越高。

粗純化條件

粗純化后的各培養(yǎng)上清液色譜圖

2糖鏈分析

使用LH-40從第1步純化獲得的抗體餾分（上圖中的黃色框內(nèi)峰）中抽取40μL進樣，并在下表的條件下進行糖鏈分析。此次培養(yǎng)的抗體被認(rèn)為其抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用（ADCC活性）越高，作為抗體藥物的效果也越好，高ADCC活性的糖鏈修飾狀態(tài)在峰3處洗脫。通過色譜圖對比可以看出，而隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，峰3的吸光度在下降，說明ADCC活性在下降。

糖鏈分析條件

各培養(yǎng)上清液中抗體糖鏈分析色譜圖

糖鏈分析的各峰面積%

3聚集體分析

使用LH-40從第1步純化獲得的抗體餾分中抽取20μL進樣，按照下表條件進行聚集體分析。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，聚集體的比例增多。綜上所述，這表明在此培養(yǎng)條件下，第四天的回收是最優(yōu)的。

聚集體分析條件

不同培養(yǎng)天數(shù)的培養(yǎng)上清液中抗體聚集體分析色譜圖

不同培養(yǎng)天數(shù)的聚集體峰面積%

4結(jié)論

從Protein A純化的結(jié)果來看，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，抗體產(chǎn)生量會變多，但通過糖鏈及聚集體分析來看，高活性抗體的比例會減少，聚集體的比例也會增加，綜合來看，選擇在第四天中回收是最合適的。

上述分析過程中，采用生物惰性超高效液相Nexera XS inert有效解決抗體金屬吸附帶來的靈敏度和重復(fù)性問題，以及提高分析效率；液體處理器LH-40集成了自動進樣和餾分收集兩大功能，通過Nexera XS inert與LH-40的組合建立了全流程的自動化，實現(xiàn)了從Protein A純化到抗體糖鏈分析及聚集體分析的完整分析系統(tǒng)。

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