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隨著低分子藥物逐漸被抗體藥物等生物藥物所取代，中分子藥物正在逐漸被人們所關(guān)注，雖然這些生物藥物展現(xiàn)出了許多優(yōu)勢(shì)，但也面臨一些難題，例如制造成本高以及由于分子量大而難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部等問(wèn)題。為了解決這些難題，中分子藥物受到了廣泛關(guān)注，通過(guò)肽合成產(chǎn)生的多肽類藥物是中分子藥物的一種。在多肽類藥物的生產(chǎn)質(zhì)控中，氨基酸序列的測(cè)定是非常重要的檢測(cè)項(xiàng)目。對(duì)于常規(guī)組成單一的合成多肽藥物來(lái)說(shuō)，氨基酸序列的分析較為簡(jiǎn)單，可通過(guò)Edman降解法或質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定，其中Edman降解法被認(rèn)為更加直接可靠。

島津最新款蛋白測(cè)序儀PPSQ-51A/53A等度系列以Edman降解法為基礎(chǔ)，將蛋白質(zhì)N-端順次切斷進(jìn)行序列分析，產(chǎn)品具有靈敏度高、等度洗脫、簡(jiǎn)便數(shù)據(jù)處理（差減色譜圖）、符合FDA 21 CFR part11規(guī)定、自動(dòng)生成報(bào)告、長(zhǎng)序列分析等特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)更靈敏、更可靠的蛋白質(zhì)N-端端氨基酸序列分析，能夠滿足用戶對(duì)微量樣品氨基酸序列的蛋白質(zhì)鑒定分析的各種需求。

【應(yīng)用案例】

PPSQ-51A/53A等度系列在進(jìn)行醋酸格拉提雷分析中的應(yīng)用

應(yīng)用介紹

醋酸格拉提雷是由四種氨基酸（L-谷氨酸（Glu）、L-丙氨酸（Ala）、L-酪氨酸（Tyr）、L-賴氨酸（Lys））構(gòu)成的、具有隨機(jī)排列特性的多肽混合物，其平均分子量在5000到9000之間。通過(guò)對(duì)醋酸格拉提雷的氨基酸組成進(jìn)行分析，已經(jīng)確認(rèn)了各氨基酸的摩爾比例。使用蛋白測(cè)序儀對(duì)醋酸格拉提雷的氨基酸序列進(jìn)行分析時(shí)，由于醋酸格拉提雷是具有隨機(jī)排列特性的多肽，雖然不能直接定量各氨基酸，但可以通過(guò)計(jì)算每種組成氨基酸的比率，從而確定N末端各氨基酸的摩爾比例。

例如，Glu的相對(duì)摩爾含量為：

Glu 相對(duì)摩爾含量=mol(Glu) / mol(Glu)+ mol(Ala)+ mol(Tyr)+ mol(Lys)

樣品制備及分析（等度系統(tǒng)）

使用的醋酸格拉提雷樣品為 Tront Research Chemicals Inc. 公司生產(chǎn)（代碼：G406800）。將準(zhǔn)備好的醋酸格拉提雷溶解于乙腈 / 0.1% 三氟乙酸水溶液 = 1:1 (體積比) 的混合溶液中，制備成濃度為 2 µg/µL 的樣品溶液。

圖1分析結(jié)果（色譜圖）

將制備的樣品溶液 3 µL 使用蛋白序列分析儀 PPSQ-51A/53A 等度系統(tǒng)進(jìn)行了氨基酸序列分析。樣品保持體采用了聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，分析結(jié)果（色譜圖）如圖1所示。

圖2各循環(huán)中構(gòu)成氨基酸殘基的摩爾比（PVDF膜） 左：摩爾比的表格 右：摩爾比的圖表

使用制備的樣品溶液進(jìn)行了相同的分析三次，圖2顯示了使用PVDF膜的分析結(jié)果，圖中的左側(cè)表格顯示了從色譜圖中獲得的每種氨基酸的產(chǎn)量除以四種氨基酸總量的值（摩爾比），使用PVDF膜進(jìn)行的三次摩爾比分析中，獲得了良好的重現(xiàn)性結(jié)果（圖中的右側(cè)）。

結(jié)論

本案例涉及使用蛋白序列分析儀 PPSQ-51A/53A 等度系統(tǒng)對(duì)由Glu（谷氨酸）、Ala（丙氨酸）、Tyr（酪氨酸）、Lys（賴氨酸）這四種氨基酸組成的具有隨機(jī)序列的多肽復(fù)雜混合物——醋酸格拉提雷進(jìn)行的分析。我們計(jì)算了所得PTH-氨基酸的產(chǎn)率比例，并確定了前5個(gè)循環(huán)中從N端部分獲得的每種氨基酸的相對(duì)摩爾比。

雖然氨基酸組成分析可以確定所有氨基酸的組成，但在確定末端部分的氨基酸組成方面存在困難，同時(shí)也證明使用蛋白序列分析儀 PPSQ-51A/53A 等度系統(tǒng)在對(duì)于醋酸格拉提雷的N端部分的質(zhì)量控制是有益的。

關(guān)聯(lián)儀器

蛋白測(cè)序儀PPSQ-51A/53A等度系列

①分析穩(wěn)定性：蛋白測(cè)序儀PPSQ-51A/53A等度系列等度分離苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH-氨基酸）。此舉改進(jìn)了基線穩(wěn)定性并支持苯乙內(nèi)酰硫脲 （PTH-氨基酸）的高靈敏度分析。等度序列分析提供更穩(wěn)定的保留時(shí)間，因此，可采用差減色譜圖處理取消前述周期檢測(cè)到的峰值，更容易識(shí)別序列。

②簡(jiǎn)單方便的數(shù)據(jù)分析：使用蛋白質(zhì)測(cè)序儀PPSQ-51A/53A等度系列的專用軟件可方便地進(jìn)行序列分析所需色譜圖的后期處理、多個(gè)色譜圖的疊加以及氨基酸序列的自動(dòng)推測(cè)。

③符合FDA21 CFR Part 11規(guī)定：實(shí)驗(yàn)室所使用的設(shè)備，需要符合計(jì)算機(jī)系統(tǒng)化驗(yàn)證(CSV)、FDA 21 CFR Part11, PIC/S GMP指南、日本厚生勞動(dòng)省電子記錄/電子署名相關(guān)的政策等規(guī)定。通過(guò)安全策略、系統(tǒng)策略、用戶權(quán)限及用戶管理功能等手段，可在高效地運(yùn)用系統(tǒng)的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)符合這些限制條件的要求。

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