EZ DNA甲基化試劑盒（50次）

EZ DNA甲基化試劑盒（50次）YK-D5005
在 3 小時內(nèi)*轉(zhuǎn)化富含 GC的 DNA. 
兩次加熱變性的反應(yīng)步驟簡化了由未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的過程 .
沒有DNA 沉淀.并且通過柱層析一步完成DNA的純化和脫硫.
洗脫的超純 DNA 對于一系列的分子生物分析是非常理想的。 

EZ DNA甲基化試劑盒（50次）YK-D5005描述
EZ DNA Methylation-Gold KitTM 是我們 EZ DNA Methylation Kit產(chǎn)品的改進版. EZ DNA Methylation-Gold Kit 將 DNA 變性過程和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變過程轉(zhuǎn)化為一步.此步驟采用溫度變性來取代以前方案中使用氫氧化鈉的化學(xué)變性過程. 經(jīng)過DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變,試劑盒可大量回收到 DNA .兩種試劑盒都是基于在胞嘧啶與亞硫酸氫鈉之間發(fā)生的使胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏さ娜椒磻?yīng). EZ DNA Methylation-Gold 與 EZ DNA Methylation Kits 都采用創(chuàng)新的柱內(nèi)脫磺酸技術(shù)來減少不必要的DNA沉淀步驟以便每次都可以提供給研究人員較好的結(jié)果.試劑盒的設(shè)計可以減少模版降解和純化過程中的DNA損失, 并且*轉(zhuǎn)化未甲基化的胞嘧啶.回收的DNA對于PCR擴增、限制性內(nèi)切酶消化、測序、微陣列等下游分析是很理想的. 右圖是 EZ DNA Methylation-Gold Kit所呈現(xiàn)出的結(jié)果.

在經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后的DNA 測序結(jié)果. 使用EZ DNA Methylation-Gold Kit處理的甲基化的CmpG (在 #5核苷酸位點)DNA.回收的DNA通過PCR來擴增并且直接測序.在 #5位置上甲基化的胞嘧啶仍然保持完整,當未被甲基化的胞嘧啶 (i.e., positions #7, 9, 11, 14 and 15)通過亞硫酸氫鹽處理完后全部轉(zhuǎn)化為尿嘧啶.



YK-D5005試劑制備

CT Conversion Reagent的制備 試劑盒中所提供的CT Conversion Reagent是固體混合物并且一定要在*使用前制備好. 通過添加 900 μl 水, 50 μl 的 M-Dissolving Buffer, 和 300 μl 的 M-Dilution Buffer 到一管的CT Conversion Reagent中. 在室溫下溶解并且震蕩10分鐘或在搖床上搖動10分鐘. 如果看到?jīng)]有溶解的試劑是很正常的, 因為在溶液中的 CT Conversion Reagent 已經(jīng)達到飽和狀態(tài).在使用之前將 CT Conversion Reagent 溶液在室溫 (20°C -30°C)下避光保存.每管的 CT Conversion Reagent 是針對10次 DNA 處理設(shè)計的.為了得到較好的結(jié)果, CT Conversion Reagent 應(yīng)當在制備后立即使用.如果不立刻使用的話, CT Conversion Reagent 溶液可以在-20°C存儲1星期.而且在使用之前存儲的 CT Conversion Reagent 溶液一定要在室溫下解凍并且通過震動或顛倒2分鐘來混合. CT Conversion Reagent 對光很敏感,所以要盡量減少在光下的暴露.

M-WASH BUFFER的制備 添加24ml (對于200次的D5006應(yīng)為96ml) 100%的乙醇到M-WASH BUFFER中來制備zui終可以使用的M-WASH BUFFER



Protocol
每次制備的DNA 范圍在 500 pg 到 2 μg之間. *量為200-500 ng. 

在PCR管中添加 130 μl 的 CT Conversion Reagent 到每 20 μl DNA 樣品中. 如果 DNA 樣品的體積小于 20 μl, 則用水來彌補差量. 通過輕彈試管或移液器操作來混合樣品. 
For Example: 4 μl DNA 樣品, 加入16 μl 水, 130 μl CT Conversion Reagent 
Note: 對于 DNA 體積 >20 μl, 就要調(diào)整 CT Conversion Reagent的制備過程. 對于每增加 10 μl DNA樣品體積來說，水的量就要隨之減少 100 μl. 例如, 40 μl DNA 樣品, 就要添加 700 μl來制備 CT Conversion Reagent. DNA 樣品的zui大體積為每次轉(zhuǎn)化反應(yīng)50 μl. 不要調(diào)整 M-Dissolving Buffer 或 M-Dilution Buffer的體積.

將樣品管放到循環(huán)變溫器并按以下步驟操作:

1. 98°C 放置 10 分鐘
2. 64°C放置2.5 小時
3. 立刻進行下述操作或者在4°C 下存儲(zui多20小時).

添加 600 μl 的 M-Binding Buffer 到 Zymo-Spin IC Column 中，并將柱放如試劑盒所提供的Collection Tube中. 

裝填樣品 (從步驟 2)到 Zymo-Spin IC? Column 含有 M-Binding Buffer. 蓋上蓋將柱顛倒數(shù)次來混合樣品.

全速 (>10,000 x g)離心 30 秒. 去除流出液.

添加 200 μl 的 M-Wash Buffer 到柱中. 全速離心30 秒.

添加 200 μl 的 M-Desulphonation Buffer 到柱中并且在室溫 (20 °C- 30 °C) 下放置 15-20 分鐘. 在培養(yǎng)后, 全速離心 30 秒.

添加 200 μl 的 M-Wash Buffer 到柱中. 全速離心30 秒. 再添加 200 μl 的 M-Wash Buffer 并且離心 30 秒.

直接添加 10 μl 的 M-Elution Buffer 到柱基質(zhì)中. 將柱放置在 1.5 ml 的管中. 全速離心來洗脫 DNA. 

DNA 可立刻進行分析或儲存在低于-20°C 下以備以后使用. 我們建議您對于每次PCR使用 2 - 4 μl洗脫的 DNA.