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廣州PCR實驗室裝修_設(shè)計

一、 PCR實驗室改造平面布局

臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)。

各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進行。

二、PCR實驗室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計及壓力控制

PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。

1、試劑貯存和準備區(qū)

該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應(yīng)直接運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。

對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴格的要求。

2、標本制備區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。

本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。

3、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為DNA或 cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的 cDNA(來自樣本制備區(qū)) 的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū)) 制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。在巢式 PCR測定中，通常在第.一輪擴增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。

本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進行。

4、擴增產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。

本區(qū)是主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。

建立方法

1、建立樣品準備區(qū)
這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采取預(yù)防措施：⑴PCR產(chǎn)物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。⑵組織培養(yǎng)物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應(yīng)該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠。⑺任何時候都應(yīng)該穿實驗服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間，經(jīng)常清洗。
2、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準備區(qū)進行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報道。
3、建立前PCR區(qū)。
該去專門用于準備各種反應(yīng)，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。
4、PCR實驗室試劑的操作。
⑴所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應(yīng)。⑷所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。⑸所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配制的試劑在用于準備新的標本之前應(yīng)該加以檢驗。⑺樣品準備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應(yīng)該小心保存。
5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物。
⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。⑵如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。⑶作為一個規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。⑸當做陽性對照時，有兩個理由決定了應(yīng)該使用少數(shù)量的核酸。⑹由于必須有對照反應(yīng)，對照模板的特點應(yīng)該予以考慮。
6、控制污染的方法。
已設(shè)計出很有力的酶學(xué)方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能*消除污染問題，但可以將污染降低幾個數(shù)量級。
7、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動

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