如何避免HILIC方法的常見問題

 HILIC方法學(xué)是一個(gè)強(qiáng)大的工具，特別適用于分析極性化合物，但實(shí)施起來可能很具挑戰(zhàn)性，并且有幾個(gè)重要的因素需要注意，以避免常見的缺陷。 本文將介紹HILIC技術(shù)，討論常見的問題領(lǐng)域，并幫助您成功地將HILIC方法整合到您的實(shí)驗(yàn)室中。

“HILIC”代表親水相互作用液相色譜。 它是一種使用極性固定相的分離模式，可以是裸硅膠，如Raptor HILIC-Si色譜柱，也可以是極性鍵合相，如Raptor FluoroPhenyl色譜柱。HILIC方法中使用的溶劑類似于反相LC中使用的溶劑（例如水，甲醇和乙腈），也可以使用揮發(fā)性緩沖劑和改性劑。 因?yàn)镠ILIC固定相是極性的，所以該技術(shù)非常適合分析在C8和C18等典型反轉(zhuǎn)相上保留有限或無保留的極性分子。

 HILIC有時(shí)也被稱為“反向反相”，因?yàn)樵诖怂?ldquo;強(qiáng)”洗脫溶劑或溶劑，與反相LC中水是“弱”溶劑相反（圖1）。在HILIC分離中，初始條件是高有機(jī)相（通常為60％或更多），并且水層被吸附在二氧化硅表面上。這種會(huì)在流動(dòng)相中形成的水層的存在有時(shí)被描述為梯度，因?yàn)楫?dāng)它接近二氧化硅表面時(shí)，它會(huì)逐漸富含水分。由于它們可溶于水層，因此極性分析物可與極性顆粒表面相互作用，并以多種方式保留，包括氫鍵合，取向力和離子交換。 例如，Raptor HILIC-Si色譜柱可提供離子交換和分配的良好組合，與其他HILIC型相比，可實(shí)現(xiàn)更多的選擇性和保留。

色譜柱活化和再平衡對(duì)于保留時(shí)間重現(xiàn)性至關(guān)重要

確保HILIC方法成功的步是了解分析柱必須在使用前進(jìn)行適當(dāng)活化，并且在進(jìn)樣之間充分平衡。 如果不能在兩次運(yùn)行之間活化并平衡色譜柱，則可能導(dǎo)致水層無法在顆粒表面*重新建立，從而導(dǎo)致保留時(shí)間不可重復(fù)。為了在使用前活化色譜柱，必須使用分析過程中將使用的流動(dòng)相進(jìn)行沖洗。對(duì)于等度HILIC方法，應(yīng)使用至少50個(gè)色譜柱體積，對(duì)于梯度HILIC方法，應(yīng)至少*運(yùn)行10次空白樣。 當(dāng)您改變流動(dòng)相組成或任何添加劑的濃度時(shí)，也需要活化。與次活化色譜柱時(shí)一樣，使用相同數(shù)量的色譜柱體積或空白進(jìn)樣。除了使用流動(dòng)相對(duì)色譜柱進(jìn)行初始活化外，重要的是色譜柱在進(jìn)樣之間重新平衡。 由于HILIC方法中的分離機(jī)理涉及在顆粒表面上吸附水層，因此在注入之間*重新建立或“重置”該水層以確保保留時(shí)間重現(xiàn)性是非常重要的。 我們建議在梯度程序返回初始條件或等度分離時(shí)開始至少10個(gè)柱體積的平衡，從后一個(gè)峰的保留時(shí)間開始至少10個(gè)柱體積。 *重新平衡所需的色譜柱體積數(shù)量可能非常依賴于分析物，尤其是等度分離時(shí)，所以請(qǐng)確保您研究HILIC方法開發(fā)過程中的保留時(shí)間重現(xiàn)性。表I列出了Raptor HILIC-Si色譜柱各個(gè)尺寸的色譜柱體積?；罨瘯r(shí)，乘以推薦的50等度方法以確定所需活化溶劑的總體積，然后除以流量計(jì)算總活化時(shí)間。 為了平衡，對(duì)于所需的平衡體積，將表中對(duì)應(yīng)于色譜柱尺寸的值乘以10; 然后除以流量計(jì)算方法程序中的平衡時(shí)間間隔。

例如，使用100 mm x 2.1 mm內(nèi)徑色譜柱時(shí)，一個(gè)色譜柱體積為0.2 mL。 如果我們運(yùn)行流速為0.30 mL/min的等度方法， 那么色譜柱應(yīng)至少用10 mL（50×0.2 mL）活化，總活化時(shí)間為33分鐘（10mL÷0.30 mL/min）。同樣，每次進(jìn)樣之間重新平衡的體積為2mL（10×0.2mL），再平衡時(shí)間為7分鐘（2 mL÷0.30 mL/min）。這些計(jì)算可用于確定一個(gè)良好的起點(diǎn)，但重新平衡時(shí)間與分析物有關(guān)，因此需要開發(fā)方法以確保重新平衡充分，并導(dǎo)致可重現(xiàn)的保留時(shí)間。

樣品溶劑匹配對(duì)于良好的峰形是至關(guān)重要的

如果您有使用反相分離的經(jīng)驗(yàn)，您會(huì)知道，如果樣品溶劑與色譜流動(dòng)相有很大差異，則峰形會(huì)有很大差異。在HILIC方法中也是如此，因此樣品溶劑盡可能匹配有機(jī)物含量高的初始流動(dòng)相是非常重要的。好消息是，如果您正在使用SPE進(jìn)行樣品制備，您將在高度有機(jī)溶劑中進(jìn)行洗脫，因此樣品提取物可能已經(jīng)準(zhǔn)備好進(jìn)行HILIC分析。圖2顯示了溶劑匹配對(duì)峰形的影響。如果樣品是100％水溶液，敵草快的峰形差，兩種化合物洗脫快，信號(hào)相對(duì)較低，而樣品溶于流動(dòng)相B（75％乙腈）。通過將注射溶劑與初始流動(dòng)相條件相匹配，您可以獲得更好的峰形，更高的保留率和更高的靈敏度。

流動(dòng)相pH值影響依賴于分析物

流動(dòng)相除了需要與樣品溶劑匹配外，流動(dòng)相的pH值也會(huì)影響色譜性能。事實(shí)上，方法開發(fā)和評(píng)估在這方面為重要， 因?yàn)閜H對(duì)分析物電荷狀態(tài)的影響因各化合物的pKa而異。使用HILIC方法時(shí)，流動(dòng)相中高濃度的有機(jī)溶劑會(huì)提高pH值， 實(shí)際的洗脫液pH值可能比單獨(dú)使用含水部分高1-1.5個(gè)單位。色譜柱本身的電荷狀態(tài)也會(huì)受到影響。例如，在Raptor HILIC-Si色譜柱中，裸二氧化硅的pKa介于3.8和4.5之間，因此流動(dòng)相pH會(huì)改變二氧化硅表面的電荷，使其在pH值接近3.8及以上，非常酸性及離子化（帶負(fù)電）的條件下呈中性。因此，如果您的分析物含有一個(gè)或多個(gè)質(zhì)子化的胺或季胺基團(tuán)，則它是使用Raptor HILIC-Si色譜柱分析的理想選擇。

緩沖液選擇影響色譜和儀器性能

緩沖液用于保持洗脫液的pH恒定，并且還可以幫助將目標(biāo)分析物與干擾物分離。許多HILIC分離使用質(zhì)譜檢測器，因此揮發(fā)性緩沖液如甲酸銨和乙酸銨應(yīng)用非常普遍。由于兩個(gè)主要原因，HILIC分離中的緩沖液濃度很重要。首先，流動(dòng)相的高有機(jī)物含量會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽沉淀在自動(dòng)進(jìn)樣器和色譜柱之間，色譜柱熔塊過濾上或色譜柱中。所有這些情況都可能導(dǎo)致您的儀器進(jìn)行停機(jī)維護(hù)。第二個(gè)考慮因素特別涉及發(fā)生在Raptor HILIC-Si色譜柱中的保留機(jī)制?；叵胍幌?，在典型的HILIC流動(dòng)相條件下，二氧化硅表面具有負(fù)電荷，因此帶正電荷的緩沖離子與目標(biāo)分析物競爭保留。如果緩沖液濃度較高，則可以降低分析物的保留時(shí)間。與pH一樣，需要優(yōu)化方法，但10 mM是緩沖液濃度的良好起點(diǎn)。 A和B兩種流動(dòng)相均應(yīng)進(jìn)行均勻緩沖，以保持梯度中的離子強(qiáng)度恒定，以獲得一致的質(zhì)譜檢測器響應(yīng)。請(qǐng)向您的MS供應(yīng)商咨詢他們推薦用于ESI源的大緩沖液濃度。

結(jié)論

與任何新技術(shù)一樣，能否成功的應(yīng)用在很大程度上取決于是否理解新方法和更熟悉的程序之間的差異。 HILIC方法為分析極性化合物提供了一種強(qiáng)大的新方法，但如果分析人員認(rèn)為其與反相LC相似，則實(shí)施可能具有挑戰(zhàn)性。 使用HILIC方法，確保色譜柱的正確活化（無論是使用新柱，還是溶劑或添加劑改變時(shí)），再就是在進(jìn)樣之間重新平衡; 將樣品溶劑與初始流動(dòng)相匹配; 并了解流動(dòng)相pH和緩沖液的選擇對(duì)分析的影響是取得良好結(jié)果的重要步驟。 這些指南為建立HILIC方法提供了一個(gè)很好的起點(diǎn)，但方法開發(fā)對(duì)于確保您的特定目標(biāo)分析物具有優(yōu)異性能至關(guān)重要。