微生物菌種如何利用了凍干燥機進行冷藏

江蘇天翎儀器凍干技術(shù)水平日益提高，企業(yè)也在賦予凍干機新的動能，比如智能化、信息化等。當(dāng)然，凍干機行業(yè)也不忘規(guī)范化地發(fā)展。凍干機起源于19世紀20年代的真空冷凍干燥技術(shù)，后真空凍干技術(shù)除了在醫(yī)藥上有著廣泛應(yīng)用，在生物制品、食品、血液制品、活性物質(zhì)領(lǐng)域之外的領(lǐng)域也發(fā)揮了重要作用。下面小編為大家介紹下微生物菌種的冷凍干燥保藏操作流程：
凍干機適用于大多數(shù)細菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的真空冷凍干燥保藏，但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。其操作流程如下：
1、安瓿管準備
安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標簽，標上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。
2、保護劑的選擇和準備
保護劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護劑時，應(yīng)注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。
3、凍干樣品的準備
在適宜的培養(yǎng)條件下將細胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯(lián)合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術(shù)規(guī)程》(試行))，與保護劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜(以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長的毛細滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應(yīng)離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，在1-2小時內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時應(yīng)注意在無菌條件下操作。
4、預(yù)凍
一般預(yù)凍2小時以上，溫度達到-20℃到-35℃左右。
5、冷凍干燥
采用凍干機進行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機的干燥箱內(nèi)，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。
終止干燥時間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：
安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀；
真空度接近空載時的zui高值；
樣品溫度與管外溫度接近；
選用1-2支對照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結(jié)；
選用一個安瓿管，裝1-2%氯化鈷，如變深蘭色，可視為干燥完結(jié)；
冷凍干燥完畢后，取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi)，備用。
6、真空封口及真空檢驗
將安瓿管頸部用強火焰拉細，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。
7、保藏
安瓿管應(yīng)低溫避光保藏。
8、質(zhì)量檢查
冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進行各項指標檢查，如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。新版GMP附錄1第三章第十一條規(guī)定應(yīng)當(dāng)對各個潔凈級別的微生物進行動態(tài)監(jiān)測，以評估無菌生產(chǎn)的微生物狀況。其中監(jiān)測方法包含沉降菌法、定量空氣浮游菌采樣法和表面取樣法等。與此同時，新版GMP更強調(diào)在關(guān)鍵操作的全過程均應(yīng)該對*潔凈區(qū)進行懸浮粒子和微生物監(jiān)測。使灌裝與凍干區(qū)域相連接的半自動進出料裝載機構(gòu)以L型布局形式出現(xiàn)，與以往的老式凍干機的大開門式相比較，因良好的隔離操作，環(huán)境控制更趨向于理性的數(shù)據(jù)控制，且無菌控制的可信度大大增加，L型布局的合理設(shè)計使*區(qū)域更集中，在環(huán)境監(jiān)測時，監(jiān)測點也更容易把握，便于實施。