血涂片是通過(guò)特定的方法將血液按一定方向均勻涂開的過(guò)程，微觀上使細(xì)胞是由球形變?yōu)槠矫嫘位蚪矫嫘纹戒佋谳d玻片上。血涂片的顯微鏡檢查是血液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的基本步驟，特別是對(duì)于各種血液病的診斷和鑒別診斷，具有重要價(jià)值。 血涂片制備是否合格、染色的好壞直接關(guān)系到檢驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量。

（一）血涂片制備

1. 載玻片的準(zhǔn)備

    新載玻片常帶有游離堿質(zhì)，須用濃度為 lmol/L 的HCl浸泡24h，再用清水*沖洗，干燥后備用。舊載玻片要用含洗滌劑的清水中煮沸20min，洗掉血膜，再用清水反復(fù)沖洗，zui后用0.95L/L乙醇浸泡1h，干燥備用。使用載玻片時(shí)，不要用手觸及玻片表面，保持玻片清潔、干燥、中性、無(wú)油膩。

2.血涂片制作方法

    取血液標(biāo)本一滴置載玻片的一端，以邊緣平滑的推片一端，從血滴前沿方向接觸血液，使血液沿推片散開，推片與載玻片保持 30～45 度夾角，平穩(wěn)地向前推動(dòng)，血液即在載玻片上形成薄層血膜(圖1—1)。

圖 2—1 血涂片的制作步驟示意圖

涂片的厚薄與血滴大小、推片與載玻片之間的角度、推片時(shí)的速度及血細(xì)胞比容有關(guān)。血滴大、角度大、速度快則血膜越厚；反之則血膜越薄。

一張良好的血涂片，要求厚薄適宜，頭體尾明顯，細(xì)胞分布均勻，血膜邊緣整齊并留有的空隙。

下面是幾種血涂片效果模式圖及形成原因 (圖l—2) 。

圖 2—2 幾種血涂片效果比較

（二）血涂片染色

染色的目的是使細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等染上不同的顏色，以便于鏡下觀察識(shí)別。

血涂片染色包括兩個(gè)過(guò)程：固定和染色。固定是將細(xì)胞蛋白質(zhì)和多糖等成分迅速交聯(lián)凝固，以保持細(xì)胞原有形態(tài)結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化。常用的染色方法有瑞特染色法 (Wright)、姬姆薩染色法(Giemsa)等。

1.瑞特（Wright）染色法

本法的特點(diǎn)是將固定和染色合并在一起進(jìn)行，手續(xù)簡(jiǎn)便，染色時(shí)間短，對(duì)白細(xì)胞特異性顆粒著色較好，但對(duì)核的著色略差。

（1）瑞特染料

由酸性染料伊紅和堿性染料美藍(lán)組成的復(fù)合染料。伊紅為鈉鹽，有色部分為陰離子。美藍(lán)為氯鹽，有色部分為陽(yáng)離子。美藍(lán)和伊紅的水溶液混合后，產(chǎn)生一種不溶于水的伊紅化美藍(lán) (ME)中性沉淀，即瑞特染料，溶解于甲醇中，即成為瑞氏染液。甲醇的作用一方面使ME溶解，并解離為M ＋ 和E － ，兩種有色離子可以選擇性地與細(xì)胞內(nèi)不同成分結(jié)合。另一方面因其具有強(qiáng)大的脫水作用，可將細(xì)胞瞬間固定，蛋白質(zhì)被沉淀為顆粒狀或者網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表面積增加，提高對(duì)染料的吸附作用，增強(qiáng)染色效果。

（2）緩沖液

pH6.4～6.8的磷酸鹽緩沖液，其作用是使染色環(huán)境維持在弱酸性，達(dá)到*的染色效果。

（3）細(xì)胞的著色原理

細(xì)胞的著色既有化學(xué)的親合作用，又有物理的吸附作用。不同的細(xì)胞由于其所含化學(xué)成分不一樣，化學(xué)性質(zhì)各不相同，所以對(duì)染料的親合力也不一樣。

①細(xì)胞中的堿性物質(zhì)與酸性染料伊紅結(jié)合染成紅色，因此，該物質(zhì)又稱為嗜酸性物質(zhì)。如紅細(xì)胞中的血紅蛋白及嗜酸粒細(xì)胞中的嗜酸性顆粒等與伊紅結(jié)合。

②細(xì)胞中的酸性物質(zhì)可與堿性染料美藍(lán)結(jié)合而染成藍(lán)紫色，該物質(zhì)又稱嗜堿性物質(zhì)。如淋巴細(xì)胞胞質(zhì)及嗜堿粒細(xì)胞的顆粒為酸性物質(zhì)，與堿性染料美藍(lán)結(jié)合。

③中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫紅色為中性物質(zhì)。另外細(xì)胞核蛋白主要由脫氧核糖核酸和強(qiáng)堿性的組蛋白等組成，與酸性伊紅結(jié)合染成紅色，但因核蛋白中還含有少量的弱酸性物質(zhì)，與堿性美藍(lán)作用染成藍(lán)色，因含量太少，藍(lán)色反應(yīng)極弱，故也被染成紫紅色。

④原始紅細(xì)胞和早幼紅細(xì)胞的胞質(zhì)含有較多的酸性物質(zhì)，與美藍(lán)親合力強(qiáng)，故染成較濃厚的藍(lán)色；隨著細(xì)胞的發(fā)育，晚幼紅細(xì)胞階段既含有酸性物質(zhì)，又含有堿性物質(zhì)（ Hb），既能與堿性染料美藍(lán)結(jié)合，又能與酸性染料伊紅結(jié)合，故染成紅藍(lán)色或灰紅色；當(dāng)紅細(xì)胞*成熟，酸性物質(zhì)*消失后，只與伊紅結(jié)合，則染成粉紅色。

圖 2－3 瑞特染色原理示意圖

（ 4）pH對(duì)細(xì)胞染色的影響

細(xì)胞著色對(duì)氫離子濃度十分敏感。細(xì)胞各種成分均由蛋白質(zhì)構(gòu)成，由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，所帶電荷的正負(fù)數(shù)量隨溶液 pH值而定。對(duì)某一蛋白質(zhì)而言，如果環(huán)境的pH小于其等電點(diǎn)（PI），則該蛋白質(zhì)帶正電荷即在酸性環(huán)境中正電荷增多，易與酸性伊紅結(jié)合，染色偏紅；相反，當(dāng)環(huán)境的pH大于PI即在堿性環(huán)境中負(fù)電荷增多，則易與美藍(lán)結(jié)合染色偏藍(lán)。因此，要使用清潔中性的載玻片、的甲醇做溶劑和用緩沖液(pH6．4～6．8)來(lái)調(diào)節(jié)染色時(shí)的pH值，達(dá)到滿意的染色效果。

（ 5）染色效果分析

正常情況：血膜外觀呈淡粉紅色或琥珀色。顯微鏡下，成熟紅細(xì)胞呈粉紅色。白細(xì)胞胞質(zhì)中顆粒清楚，并顯示出各種細(xì)胞*的色彩，細(xì)胞核染紫紅色，核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚。

染色偏酸：紅細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞顆粒偏紅，白細(xì)胞核呈淡藍(lán)色或不著色。

染色偏堿：所有細(xì)胞呈灰藍(lán)色，顆粒深暗；嗜酸粒細(xì)胞可染成暗褐色，甚至紫黑色或藍(lán)色；中性顆粒偏粗，染成紫黑色。

圖 2—4 不同染色效果的細(xì)胞比較

2.姬姆薩(Giemsa)染色法

姬姆薩染料由天青和酸性染料伊紅組成的復(fù)合染料。染色原理、緩沖液與瑞特染色法大致相同。本法對(duì)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和寄生蟲著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更為清晰，但細(xì)胞質(zhì)和顆粒著色較差。

3. 瑞－姬染色法

瑞特染色液和姬姆薩染色液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)有各自的顯色特征，前者對(duì)細(xì)胞漿和顆粒著色較好，后者對(duì)對(duì)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)顯示清晰。因此將瑞特染料和姬姆薩染料混合，甲醇溶解后組成瑞－姬染色液能取長(zhǎng)補(bǔ)短，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，其中所使用的緩沖液與瑞特染色法相同。用該混合染液對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行染色，細(xì)胞核、細(xì)胞漿和細(xì)胞內(nèi)顆粒著色均有上佳表現(xiàn)，著色鮮艷，對(duì)比鮮明，是臨床上廣泛使用的方法。

（三）血涂片染色的質(zhì)量控制

1．載玻片必須非常潔凈，中性，無(wú)油脂。不清潔或非中性的載玻片會(huì)造成細(xì)胞特別是紅細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，導(dǎo)致假性的異常形態(tài)紅細(xì)胞出現(xiàn)。非中性的載玻片還會(huì)影響染色環(huán)境的pH值，帶油脂的載玻片會(huì)使細(xì)胞分布不均勻。

2．良好血涂片的“標(biāo)準(zhǔn)”。血膜由厚到薄逐漸過(guò)度，血膜的體尾交界部位紅細(xì)胞分布均勻，既不重疊又互相緊靠相連。

3. EDTA抗凝血液制備血涂片。由于EDTA能阻止血小板聚集，如需在顯微鏡下觀察血小板形態(tài)時(shí)可采用，但EDTA抗凝血有時(shí)能引起紅細(xì)胞皺縮和白細(xì)胞聚集，所以應(yīng)根據(jù)情況恰當(dāng)選擇。

4. 白細(xì)胞較低和需濃縮白細(xì)胞的標(biāo)本處理。為獲得較多白細(xì)胞，可將抗凝血適當(dāng)離心，使密度相同細(xì)胞集中并分層，然后取紅細(xì)胞層上薄的灰白色層（有核細(xì)胞和血小板較集中)涂片、染色。該方法非常適合于白細(xì)胞減低患者的白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及紅斑狼瘡細(xì)胞檢查。

5. 血細(xì)胞比容與涂片關(guān)系。血細(xì)胞比容高于正常時(shí)，紅細(xì)胞較多，血液粘度較高，用較小的角度涂片，可獲得滿意的血膜。相反，血細(xì)胞比容低于正常時(shí)，血液粘度較低，需用較大角度涂片。

6.新配制的瑞氏染液處置。新配制的瑞氏染液包括瑞－姬染液，pH偏堿，染色效果不太理想，需在室溫放置一段時(shí)間，其中美藍(lán)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樘烨郆。在密封條件下，貯存時(shí)間愈久，轉(zhuǎn)化的天青B愈多，染色效果愈好。

7.染色過(guò)深、過(guò)淺的處理。染色過(guò)深、過(guò)淺與血涂片中細(xì)胞數(shù)量、血膜厚度、染色時(shí)間、染液濃度、pH值密切相關(guān)。對(duì)于重要的標(biāo)本可采用先試染的方法，根據(jù)試染效果調(diào)節(jié)第二次染色方式。糾正染色過(guò)深可縮短染色時(shí)間或稀釋染液。糾正染色過(guò)淺可延長(zhǎng)染色時(shí)間。如果標(biāo)本片有限出現(xiàn)了染色過(guò)深、過(guò)淺的情況，可用如下辦法挽救：染色過(guò)深可加少量緩沖液覆蓋血膜部分褪色，在顯微鏡下觀察褪色情況及時(shí)終止。染色過(guò)淺可重加染色液和緩沖液復(fù)染，也要在顯微鏡下觀察及時(shí)終止。