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和元李記(上海)生物技術(shù)...

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Pikogreen熒光染料使用方法

閱讀:2733      發(fā)布時(shí)間:2018-5-24
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使用方法

1. PikoGreen工作液的配制

使用前將PikoGreen dsDNA定量試劑回溫至室溫;PikoGreen是以100µL 200×的濃縮液形式保存于無水DMSO中的(共10管),實(shí)驗(yàn)當(dāng)天,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求用1×TE1:200 的比例稀釋適量定量試劑濃縮液。例如要準(zhǔn)備足夠的操作溶液以2ml檢測體系測定20個(gè)樣品,可向19.9mL 1×TE 中加入100μL PikoGreen dsDNA 定量試劑。工作液見光易降解,盡量在配好后幾小時(shí)內(nèi)使用。

2. 配制標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液

1) 1 X TE溶液溶解dsDNA制備1μg/mL dsDNA 。根據(jù)在1cm 光程長度的比色杯中A260nm時(shí)的吸光度確定DNA 濃度;相應(yīng)于1μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。標(biāo)準(zhǔn)液常用小牛胸腺DNA制備,PikoGreen 試劑測定法在通常污染核酸制劑的幾種復(fù)合物存在的條件下仍能保持線性良好,但是,為了得到有效的對照處理,被用來做標(biāo)準(zhǔn)曲線的dsDNA 溶液要用和實(shí)驗(yàn)樣品相同的方式來處理,并且應(yīng)該包含相同的可能存在的污染物。

2) 制備從0.5ng/mL 500ng/mL(見表1)單重復(fù)個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液,然后與等體積的PikoGreen 工作液混和,放入1 x 1cm 比色杯中。混合相同體積的1 x TE PikoGreen 操作溶液作為空白對照,避光于室溫下放置2-5 分鐘。

 

1: 1 x 1cm 比色杯時(shí)DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃度配制參考

標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液濃度(ng/mL

標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液體積(mL

PikoGreen 工作液體積(mL

標(biāo)準(zhǔn)DNA 終濃度(ng/mL)

1000

1

1

500

200

1

1

100

50

1

1

25

20

1

1

10

5

1

1

2.5

2

1

1

1

1

1

1

0.5

0

1

1

空白

3) 當(dāng)用微量檢測皿適配器時(shí),PikoGreen 測定也可在較低的測定體積(50μ200μL)內(nèi)完成。產(chǎn)生從1ng/mL 100ng/mL(見表2)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液,然后與等體積的PikoGreen 工作液混和,將至少50μ溶液轉(zhuǎn)移到微量檢測皿中。確信不要在樣品中引入氣泡,輕輕地彈微量檢測皿的外部經(jīng)??梢则?qū)散氣泡。避光于室溫下放置2-5 分鐘。

2:用微量檢測皿DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃配制參考

標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液濃度(ng/mL

標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液體積(mL

PikoGreen 工作液體積(mL

標(biāo)準(zhǔn)DNA 終濃度(ng/mL)

200

30

30

100

50

30

30

25

20

30

30

10

5

30

30

2.5

2

30

30

1

0

30

30

空白

4) 孵育后用合適的熒光計(jì)測量樣品熒光值。Ex/Em=480nm/520nm,為了減少光漂白,應(yīng)保持所有樣品的檢測時(shí)間一致。用熒光值zui大的樣品校正儀器。

5) 用檢測數(shù)據(jù)與DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度做回歸分析,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 樣品分析

1) 1 x TE 稀釋待測DNA 樣品至需要的體積(1x1cm 比色杯需1.0mL,微量檢測皿需25-100μL)。對樣品高度稀釋可以確保任何污染物都被zui大限度地沖淡。然而,也要避免取樣體積太小而無法吸取的情況。

2) 在每個(gè)樣品中加入等體積PikoGreen 工作液,混合好,將混合物移入合適的比色杯,避光于室溫下放置2-5 分鐘。

3) 檢測、讀取熒光值,換算樣品中dsDNA濃度。可以對樣品進(jìn)行不同的稀釋處理重復(fù)測定以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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