PikoGreen dsDNA quantitation reagent(優(yōu)于PicoGreen)

PikoGreen是一種極為靈敏的雙鏈DNA熒光染料，于雙鏈DNA的定量。測定DNA濃度在cDNA文庫構(gòu)建、DNA亞克隆、PCR產(chǎn)物估測等領(lǐng)域中非常重要，另外疫苗等生物制品中殘留微量DNA的檢測因關(guān)系人身健康，顯得尤為重要。

相比傳統(tǒng)的方法，Pikogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下優(yōu)勢：①靈敏：數(shù)量級(jí)較UV吸光讀數(shù)更敏感，可節(jié)省樣品；②特異性強(qiáng)：只結(jié)合dsDNA，特異性強(qiáng)，不受樣品常規(guī)污染影響。傳統(tǒng)紫外吸光法容易受樣品中存在的單鏈DNA，蛋白，RNA等影響；③耐受性好：耐受較高濃度的鹽、尿素、乙醇、去垢劑、蛋白或瓊脂糖，可以直接定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物而無需從反應(yīng)混合物中純化DNA。④線性范圍寬：PikoGreen dsDNA染料測定DNA濃度，在100pg/ml-100ng/ml范圍內(nèi)呈良好線性；熒光計(jì)兼容。⑤容易使用：在樣品中加入染料，等待5-6分鐘染色，然后讀數(shù)即可，且適用于96和384孔板；與大多數(shù)基于熒光的酶標(biāo)儀和可適用于各種DNA樣品分析，PCR的分析、芯片樣品、DNA損傷分析、酶活性分析、基因組DNA定量以及復(fù)雜混合物中dsDNA的檢測和病毒DNA定量等多種領(lǐng)域。

PikoGreen僅與DNA雙鏈結(jié)合后才發(fā)出熒光，且所產(chǎn)生的熒光與DNA濃度呈正比，在存在ssDNA、RNA和單體核苷酸的條件下，可以選擇性地檢測低至25pg/ml的dsDNA。該分析在四個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)呈線性，且?guī)缀鯚o序列依賴性，可以精確地測量多個(gè)來源的DNA，包括基因組DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。該方法因其穩(wěn)定性、靈敏性，已經(jīng)錄入《中國藥典》。

使用96孔板檢測，每次使用量200µl，則1ml PikoGreen定量試劑可以做2000次分析。PikoGreen以每管1ml的形式提供，Cat#D1101L1121。另外，李記生物特別研發(fā)了【Pikogreen dsDNA定量檢測試劑盒（Cat# D1201L2221）】方便客戶選用。

PikoGreen dsDNA quantitation reagent(優(yōu)于PicoGreen)運(yùn)輸和保存方法

常溫運(yùn)輸。4℃避光干燥保存，有效期6個(gè)月。

PikoGreen dsDNA quantitation reagent(優(yōu)于PicoGreen)使用方法

1. PikoGreen工作液的配制

使用前將PikoGreen dsDNA定量試劑回溫至室溫；PikoGreen是以100µL 200×的濃縮液形式保存于無水DMSO中的（共10管），實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求用1×TE按1:200 的比例稀釋適量定量試劑濃縮液。例如要準(zhǔn)備足夠的操作溶液以2ml檢測體系測定20個(gè)樣品，可向19.9mL 1×TE 中加入100μL PikoGreen dsDNA 定量試劑。工作液見光易降解，盡量在配好后幾小時(shí)內(nèi)使用。

2. 配制標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液

1) 用1 X TE溶液溶解dsDNA制備1μg/mL dsDNA 。根據(jù)在1cm 光程長度的比色杯中A260nm時(shí)的吸光度確定DNA 濃度；相應(yīng)于1μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。標(biāo)準(zhǔn)液常用小牛胸腺DNA制備，PikoGreen 試劑測定法在通常污染核酸制劑的幾種復(fù)合物存在的條件下仍能保持線性良好，但是，為了得到有效的對(duì)照處理，被用來做標(biāo)準(zhǔn)曲線的dsDNA 溶液要用和實(shí)驗(yàn)樣品相同的方式來處理，并且應(yīng)該包含相同的可能存在的污染物。

2) 制備從0.5ng/mL 到500ng/mL（見表1）單重復(fù)8 個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，放入1 x 1cm 比色杯中?；旌舷嗤w積的1 x TE 和PikoGreen 操作溶液作為空白對(duì)照,避光于室溫下放置2-5 分鐘。

表1: 用1 x 1cm 比色杯時(shí)DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃度配制參考

3) 當(dāng)用微量檢測皿適配器時(shí)，PikoGreen 測定也可在較低的測定體積（50μL 到200μL）內(nèi)完成。產(chǎn)生從1ng/mL 到100ng/mL（見表2）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，將至少50μL 溶液轉(zhuǎn)移到微量檢測皿中。確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測皿的外部經(jīng)?？梢则?qū)散氣泡。避光于室溫下放置2-5 分鐘。

表2：用微量檢測皿DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃配制參考

4) 孵育后用合適的熒光計(jì)測量樣品熒光值。Ex/Em=480nm/520nm，為了減少光漂白，應(yīng)保持所有樣品的檢測時(shí)間*。用熒光值zui大的樣品校正儀器。

5) 用檢測數(shù)據(jù)與DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度做回歸分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 樣品分析

1) 用1 x TE 稀釋待測DNA 樣品至需要的體積（1x1cm 比色杯需1.0mL，微量檢測皿需25-100μL）。對(duì)樣品高度稀釋可以確保任何污染物都被zui大限度地沖淡。然而，也要避免取樣體積太小而無法精確吸取的情況。

2) 在每個(gè)樣品中加入等體積PikoGreen 工作液，混合好，將混合物移入合適的比色杯，避光于室溫下放置2-5 分鐘。

3) 檢測、讀取熒光值，換算樣品中dsDNA濃度?？梢詫?duì)樣品進(jìn)行不同的稀釋處理重復(fù)測定以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

注意事項(xiàng)

1) PikoGreen定量試劑含有DMSO，PikoGreen 是結(jié)合dsDNA，操作時(shí)采取適當(dāng)防護(hù)，戴手套小心操作；

2) 盡管常見污染物不會(huì)影響PikoGreen 檢測dsDNA濃度（見PikoGreen耐受污染物列表），但是當(dāng)樣品中dsDNA濃度太低，RNA, ssDNA濃度超過dsDNA 10倍以上時(shí)，RNA, ssDNA等污染還是會(huì)對(duì)檢測結(jié)果產(chǎn)生較大干擾，在此種情況下，RNA 酶可以消除RNA干擾, RNA 酶A、酶T1 、核酸酶S1 結(jié)合能除去ssDNA干擾，從而保證樣品熒光值是由dsDNA 產(chǎn)生。

附表：Pikogreen定量耐受的污染物列表