EZ Trans細胞轉(zhuǎn)染液

    細胞轉(zhuǎn)染液（核心成分為線性聚乙烯亞胺，也稱作LPEI），是新一代的轉(zhuǎn)染試劑，帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團 形成帶正電的復合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過胞吞作用進入細胞。除了具有陽離子脂質(zhì)體（如：Lipo2000,3000）的轉(zhuǎn)染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復性好等特點外，還具有在體內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性低等特點。

    EZ Trans是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡在任何pH下都能充當有效的“質(zhì)子海綿”體。其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細胞毒性低。

EZ Trans細胞轉(zhuǎn)染液使用方法：

瞬時轉(zhuǎn)染方法

1. 接種細胞：轉(zhuǎn)染前一天，用膠原酶消化細胞并計數(shù)（不建議用胰酶）。調(diào)整細胞濃度，將細胞鋪入細胞培養(yǎng)的器皿，每個孔置入的細胞量應能使轉(zhuǎn)染時細胞匯合度達到 70~80%。

2. 準備 DNA-PEI 復合物： DNA、EZ Trans 試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其升至室溫。依據(jù)下表所示，用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他適合的無蛋白培養(yǎng)基稀釋適量 DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋EZ Trans 試劑。每 1 μg DNA 需用2-5 μL EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液的試管，一邊將稀釋的EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑滴加至試管中（注意：請勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置 10~25 min 以形成DNA-PEI復合物。當溶液體積較大時，請用圓底聚丙烯管，例如 Falcon 5 mL /14 mL 離心管。

3. 轉(zhuǎn)染細胞：直接向每個孔中加入 DNA-PEI復合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在無血清條件下轉(zhuǎn)染時，去除生長培養(yǎng)基，替換成無血清培養(yǎng)基，然后滴DNA-PEI復合物。轉(zhuǎn)染 3 h 后，添加1/2體積的包含 30%血清的生長培養(yǎng)基。

4. 孵育細胞和分析結(jié)果：在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細胞至可以分析檢測。轉(zhuǎn)染后zui快 7h 即可檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達。請自行確定檢測時間。?

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法

1. 接種細胞：轉(zhuǎn)染前一天，用胰酶消化細胞并計數(shù)。調(diào)整細胞濃度，將細胞鋪入細胞培養(yǎng)的器皿，總體積如表 1 所示，每個孔置入的細胞量應能使轉(zhuǎn)染時細胞匯合度達到 70~80%。

2. 準備 DNA-PEI 復合物： DNA、PEI 試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其升至室溫。依據(jù)表 1 所示，用 Opti-MEM ITM（Invitrogen）或其他適合的無蛋白培養(yǎng)基稀釋適量 DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋PEI 試劑。每 1 μg DNA 需用2-5 μL EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液的試管，一邊將稀釋的EZ Trans轉(zhuǎn)染試劑滴加至試管中（注意：請勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置 10~25 min 以形成 DNA-PEI復合物。當溶液體積較大時，請用圓底聚丙烯管，例如 Falcon 5 mL /14 mL 離心管。

3. 轉(zhuǎn)染細胞：直接向每個孔中加入 DNA-PEI復合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在無血清條件下轉(zhuǎn)染時，去除生長培養(yǎng)基，替換成無血清培養(yǎng)基，然后滴DNA-PEI復合物。轉(zhuǎn)染 3 h 后，添加½體積的包含 30%血清的生長培養(yǎng)基。

4. 孵育細胞和分析結(jié)果：在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃下孵育細胞至可以分析檢測。轉(zhuǎn)染后zui快 7h 即可檢測到轉(zhuǎn)入基因的表達。

5.轉(zhuǎn)染 24 h 后，將細胞傳代至新鮮的生長培養(yǎng)基中（將細胞稀釋 10 倍以上），在 CO2培養(yǎng)箱中 37℃孵育隔一晚。第二天加入與轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的篩選藥物。約 1~2 周可篩選到耐藥性克隆，在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長培養(yǎng)基。

EZ Trans細胞轉(zhuǎn)染液運輸與保存方法：

    常溫運輸，4℃保存，保質(zhì)期12個月。

EZ Trans細胞轉(zhuǎn)染液使用注意事項:

    質(zhì)粒質(zhì)量：請務必使用高質(zhì)量轉(zhuǎn)染級無內(nèi)毒素質(zhì)粒。通過 260 nm 光吸收測定 DNA 濃度，260 nm / 280 nm 比值確定 DNA 純度（比值應該在 1.8~2.0 的范圍之內(nèi)）。如有可能，請通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒的完整性。

    細胞條件：使用適當保存和經(jīng)常傳代的健康細胞。確保培養(yǎng)基沒有被細菌、真菌或支原體污染。如果細胞是近期復蘇的液氮凍存細胞，請在轉(zhuǎn)染前至少傳代兩次。建議使用GIBCO或者李記生物的胎牛血清培養(yǎng)細胞。?

特別提醒:

1. 對于某些類型的細胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細胞，在轉(zhuǎn)染前兩天鋪板可顯著提高轉(zhuǎn)入基因的表達水平。如果選擇轉(zhuǎn)染前兩天鋪板，可適當降低鋪板密度，以確保轉(zhuǎn)染時細胞的匯合度仍為 70~80%。

2. 對于接觸抑制敏感的細胞，可適當降低鋪板密度。

3. 即使在有蛋白（如 10%的血清）存在的情況下，DNA-PEI復合物仍能轉(zhuǎn)染細胞，但是 DNA-PEI復合物必須在無蛋白存在的條件下形成。

4. 對大多數(shù)細胞來而言，每 1 μg DNA 使用 3.0 μLEndoFectinTM 試劑都能獲得較高轉(zhuǎn)染效率。使用者也可嘗試每 1 μg DNA 使用 1~4 μL 體積線性PEI轉(zhuǎn)染試劑進行優(yōu)化。