Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品描述
　　本試劑盒為Annexin V與PI聯(lián)合使用的試劑盒，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡早期的發(fā)生，可區(qū)分凋亡早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡或壞死細(xì)胞。
　　Annexin V為胞內(nèi)蛋白膜聯(lián)蛋白家族成員，以鈣離子依賴(lài)的方式選擇性與磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合。PS正常分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)。PS外翻到細(xì)胞膜外是不同類(lèi)型的細(xì)胞在凋亡早期的明顯特征，用帶有FITC標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-FITC，可通過(guò)流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)到這一重要特征。FITC呈現(xiàn)黃綠色熒光。
　　PI（Propidium Iodide, 碘化丙啶）是一種可對(duì) DNA 染色的細(xì)胞核染色試劑，在嵌入DNA 后釋放紅色熒光。PI不能穿透完整的細(xì)胞膜，但可以穿透壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞。
　　Annexin V-FITC與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI 被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被 FITC 和PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性（Annexin V+/PI+）。
　　FITC大吸收波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)分別為494nm和518 nm，PI-DNA復(fù)合物的大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)分別為535 nm和617 nm。

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產(chǎn)品組分

保存方法
　　2~8℃避光保存，一年有效。注意不可冷凍。
使用方法
　　下列實(shí)驗(yàn)方案以利用星形孢菌素誘導(dǎo) Jurkat 細(xì)胞凋亡為例，如果使用其他誘導(dǎo)劑和其他類(lèi)型的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)條件需要略作調(diào)整。
1.流式細(xì)胞檢測(cè)
（1）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。檢測(cè)樣品中應(yīng)包含未經(jīng)處理的細(xì)胞樣品，作為陰性對(duì)照。此外，建議設(shè)定一組樣品做單染，用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
（2）收集細(xì)胞。
懸浮細(xì)胞：300 g，4℃離心 5 min 收集細(xì)胞；
貼壁細(xì)胞：用不含 EDTA 的胰酶消化后 300 g，4℃離心 5 min收集細(xì)胞，胰酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以防引起假陽(yáng)性。
【注】：用胰蛋白酶消化然后使細(xì)胞在合適的細(xì)胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復(fù)約30 min，然后再染色。 胰蛋白酶消化會(huì)暫時(shí)破壞質(zhì)膜，允許Annexin V結(jié)合磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)表面上，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性染色。
（3）用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞兩次，每次均在 300 g，4℃下離心 5 min，收集 1-5×10⁵ 個(gè)細(xì)胞并用100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。
（4）每管加入 4-5 μL 的 FITC-Annexin V 和 5 μL 的 PI工作液。
【注】：我們推薦準(zhǔn)備兩管額外的流式管，每管只加入一種單染染料（FITC-Annexin V 和PI），用于流式單染的補(bǔ)償調(diào)節(jié)。
（5）室溫避光孵育 10-15 min，為避免細(xì)胞凋亡進(jìn)程，孵育過(guò)程可在冰上操作。
（6）每管加入 400 μL 的 PBS 或 1×結(jié)合緩沖液，盡快通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。FITC-Annexin V 可以由 488nm 激光激發(fā)，檢測(cè)熒光發(fā)射光譜約在 530 nm 處（FITC 通道），PI 通道發(fā)射光譜約在 617 nm 處。
【注】：PBS 或 1×結(jié)合緩沖液的選擇根據(jù)不同凋亡處理以及不同細(xì)胞具體選擇。
2.熒光顯微鏡檢測(cè)
對(duì)于懸浮細(xì)胞，可參照流式細(xì)胞檢測(cè)的方法進(jìn)行具體操作。
（1）在蓋玻片或載玻片小室中接種細(xì)胞。
（2）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。檢測(cè)樣品中應(yīng)包含未經(jīng)處理的細(xì)胞樣品，作為陰性對(duì)照。
（3）用 PBS 洗滌細(xì)胞。
【注】：細(xì)胞收集后如果不用 PBS 清洗，可以用含血清的培養(yǎng)基直接替代Annexin V 結(jié)合緩沖液，但是 Annexin V 的使用濃度需要重新優(yōu)化。
（4）每 100 μL 的 Annexin V 結(jié)合緩沖液中加入 5-25 μL 的 FITC-Annexin V 和 5 μL 的 PI。
【注】：合適的使用濃度由具體實(shí)驗(yàn)要求確定。
（5）向培養(yǎng)板中加入足量的染液以覆蓋全部細(xì)胞，室溫避光孵育 15-30 min。為避免細(xì)胞凋亡進(jìn)程，孵育過(guò)程可在冰上操作，但孵育時(shí)間至少延長(zhǎng)至 30 min。
（6）用 1×結(jié)合緩沖液清洗細(xì)胞。
（7）將孵育有細(xì)胞的蓋玻片置于載玻片上，載玻片可提前加一滴 1×結(jié)合緩沖液；對(duì)于培養(yǎng)在小室內(nèi)的細(xì)胞，可直接加入足量的 1×結(jié)合緩沖液覆蓋細(xì)胞。
（8）使用合適的濾光片在熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞。FITC-Annexin V 可用 FITC 適用的濾光片，PI 可用 Cy3 或者 Texas。
注意事項(xiàng)：
1.該產(chǎn)品*于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
2.熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，保存和使用過(guò)程中請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
3.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。