EZ 555 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(橙紅熒光)

產(chǎn)品描述
　　細(xì)胞凋亡的一個顯著特點是細(xì)胞染色體 DNA 的降解，這是一個較普遍的現(xiàn)象。這種降解非常特異并有規(guī)律，所產(chǎn)生的不同長度的 DNA 的片段約為 180 bp-200 bp 的整數(shù)倍，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀 Ladder 圖譜，EZ 555 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(橙紅熒光)采用 TUNEL 法，應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡細(xì)胞斷裂DNA 的3´-OH 末端催化摻入EZ 555-dUTP。EZ 555-dUTP標(biāo)記的 DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細(xì)胞儀定量。 TUNEL法可以選擇性的檢測凋亡細(xì)胞，而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細(xì)胞。TUNEL 實驗中， TdT 酶催化 dUTP 摻入斷裂的 DNA 鏈的3´-OH末端?？乖瓨?biāo)記的 dUTP（如digoxin-dUTP、生物素-dUTP），因為它可以直接進(jìn)行原位檢測，是一種更快速、直接的檢測手段。
訂購信息
 

產(chǎn)品組分
 

保存方法
　　本產(chǎn)品應(yīng)置于-20℃儲存； TUNEL Reaction Buffer 避光儲存于-20℃，避免反復(fù)凍融。有效期見外包裝。
【注】：TUNEL Equilibration Buffer和TUNEL Reaction Buffer中含有有毒、致癌成分Sodium cacodylate trihydrate和Cobaltous chloride，使用時請佩戴口罩、手套，接觸皮膚后，請立即有大量水沖洗，廢液請按有毒物質(zhì)處理。
實驗材料（自備）
PBS 緩沖液（pH~7.4）
4%多聚 jia quan （in PBS）
牛血清白蛋白(BSA)或正常的羊、牛血清
70%乙醇（自選）
脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）
操作步驟
1.樣本準(zhǔn)備：
細(xì)胞樣品
（1）可選：準(zhǔn)備一份陰性對照樣本（加入不含TdT酶的TUNEL反應(yīng)液）。
（2）PBS清洗細(xì)胞兩次。
（3）細(xì)胞固定：加入適量 4%多聚 jia quan (pH 7.4)溶液，4℃放置30 min。
（4）PBS清洗細(xì)胞兩次。
（5）通透細(xì)胞：加入冰上預(yù)冷的 70%乙醇，在-20℃孵育 4 h。細(xì)胞能在70%乙醇中-20℃的條件下保存一周?；蛘呒?xì)胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透，室溫放置20 min。
（6）PBS清洗細(xì)胞兩次。
石蠟組織切片
（1）室溫下用二甲苯浸泡石蠟組織切片2次，每次5 min， 以*脫掉石蠟。
【注】：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請在通風(fēng)櫥中進(jìn)行此操作。
（2）室溫下，將切片樣本浸沒于無水乙醇中漂洗2次，每次5 min。
（3）室溫下，將切片樣本連續(xù)浸沒在不同濃度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每種濃度各漂洗1次，每次5 min。
（4）室溫下，將切片浸沒于純水中漂洗1次，每次3 min，再將切片浸沒于1×PBS中漂洗1次，每次3 min，用濾紙小心吸干切片樣本周圍多余液體。
（5）用免疫組化筆在切片樣本周圍描繪樣品輪廓，以便下游通透與標(biāo)記。
（6）按1:100的比例，將 2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀釋，使其終濃度為 20 µg/mL。每個樣本上滴加 100 µL稀釋好的Proteinase K溶液， 使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域， 室溫孵育 20 min（Proteinase K 的孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化）。
【注】：蛋白酶K可以幫助滲透組織，但延長孵育時間可能導(dǎo)致切片脫落，所以要優(yōu)化孵育時間長短。時間一般為10~30 min，4 µm左右的片子可以用10 min，但30 µm左右的可用30 min。過長易脫片、過短起不到通透效果。
（7）PBS浸潤清洗切片兩次，每次5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。
【注】：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。
冰凍組織切片
（1）將冰凍切片放置于室溫的片架上，室溫20 min，晾干。
（2）將載玻片浸沒在4%多聚 jia quan 溶液（in PBS）中，室溫固定30 min。
（3）PBS 浸潤清洗切片兩次，每次5 min。
（4）用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。
（5）按1:100的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀釋， 使其終濃度為20 µg/mL。每個樣本上滴加100 µL稀釋好的 Proteinase K溶液， 使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育 10 min（Proteinase K 的孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化）。
【注】：蛋白酶K可以幫助滲透組織，但延長孵育時間可能導(dǎo)致切片脫落，所以要優(yōu)化孵育時間長短。時間一般為10~30 min，4 µm左右的片子可以用10 min，但30 µm左右的可用30 min。過長易脫片、過短起不到通透效果。
（6）PBS 浸潤清洗切片兩次，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤。
陽性處理(僅陽性對照進(jìn)行此步驟，其他樣品直接進(jìn)行TUNEL反應(yīng)步驟)
（1）按1:10的比例用ddH2O將10 × DNase I Buffer稀釋成1 × DNase I Buffer備用。
（2）滴加100 µL 1 × DNase I Buffer到已通透的樣本上，室溫平衡5 min。
（3）用1 × DNase I Buffer 以1:100稀釋DNase I (2 U/μL)，使其為終濃度20 U/mL的工作液。
（4）輕輕吸掉多余液體，加入100 μL濃度為20 U/mL DNase I工作液，室溫孵育10 min。
（5）輕輕吸掉多余液體，PBS清洗樣品2次。
2. TUNEL 反應(yīng)：
（1）每個樣本加入 100 μL TUNEL 平衡緩沖液，孵育 5 min。
（2）預(yù)先配制 TUNEL 反應(yīng)混合液：每個樣本需要已加入1 μL TdT 酶的 50 μL TUNEL 反應(yīng)緩沖液。
（3）棄去平衡緩沖液，用濾紙小心吸去切片樣本周圍的多余液體，每個樣本加入 50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液。
a.貼壁細(xì)胞，用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育 60 min。
b.懸浮細(xì)胞，可加入微孔板中，采用微孔板振蕩器進(jìn)行孵育或每隔 15 min 溫和的震蕩反應(yīng)管，使之充分反應(yīng)。37℃避光孵育 60 min。
c.組織樣本，用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本。將樣本平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育2小時，濕盒底部鋪一張含少量水的紙巾保持濕度。37℃避光孵育2 h。
（4）去掉反應(yīng)液，在1×PBS 的染色缸中浸泡潤洗2次，每次5 min。再使用適量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100，其中含 5 mg/mL BSA 的緩沖液清洗樣本3 次，每次5 min，以降低背景。
（5）（可選）復(fù)染：每個樣本滴加濃度為2 μg/mL 的DAPI染液，避光室溫孵育10 min。染色完后，輕輕去掉染液，并將樣本在1×PBS中浸泡潤洗3次，每次5 min。
（6）（可選）封片：將樣本先純水浸沒5 min，再放入70%乙醇浸沒5 min，再80%乙醇浸沒5 min，90% 乙醇浸沒5 min，95% 乙醇浸沒5 min，無水乙醇浸沒5 min，后將切片樣本置于染色缸中以新鮮的二甲苯浸泡透明化處理2次，每次5 min（通風(fēng)廚中操作）。脫水完成后，擦去切片周圍的液體，每個切片樣本滴加50 μL抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片*。
（7）用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀觀察、分析，EZ 555 與 Texas Red 染料的光譜類似，激發(fā)波長、發(fā)射波長分別為 555 nm，565 nm（凋亡細(xì)胞應(yīng)被標(biāo)記上明亮的紅色熒光，沒有加入 TdT 酶的陰性對照樣本未被標(biāo)記上熒光）。
注意事項

1. 該產(chǎn)品*于科學(xué)實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
2. 熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。