人白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫分析

部分 ELISA 簡介
ELISA 是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。自上
世紀(jì) 70 年代初問世 以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用 于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。
ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原
或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。
在測定時(shí)，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗
滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗
原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一
定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)
的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地
放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。
第二部分 ELISA 的樣本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
在收集樣本前都必須有一個(gè)完整的計(jì)劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對(duì)收集后
當(dāng)天就進(jìn)行檢測的樣本，及時(shí)儲(chǔ)存在 4℃?zhèn)溆谩?duì)于隔天再檢測的樣本，及時(shí)分裝后凍存在-
20℃?zhèn)溆?，有條件的，-70℃凍存?zhèn)溆?。?biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。
液體類標(biāo)本: 包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。
1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集
上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離
心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再
次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程
中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/
分）。仔細(xì)收集上清。
5. 培養(yǎng)細(xì)胞：檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到 100
萬/ml 左右。通過反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。
離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再
次離心。
6. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?br />標(biāo)本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑，
用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿化。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。
分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
7. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)
行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
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8. 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
第三部分 ELISA 試劑盒的檢測目的和實(shí)驗(yàn)原理
1.檢測目的
本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）含量。
2.實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）水平。用純化 的人白細(xì)
胞介素 1β（IL-1β）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中 依次加入白細(xì)
胞介素 1β（IL-1β），再與 HRP 標(biāo)記的白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）抗 體結(jié)合，形成抗體-抗
原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，
并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）呈正相
關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標(biāo) 準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人白細(xì)胞介
素 1β（IL-1β）濃度。