Ultimate色譜柱說(shuō)明書(shū)
色譜柱的正確使用
色譜柱是昂貴的色譜耗材,正確的使用和維護(hù)對(duì)保證色譜柱的正常使用和延長(zhǎng)壽命至關(guān)重要。
1. 色譜柱使用前注意事項(xiàng):
1) 色譜柱內(nèi)的存儲(chǔ)液:
月旭公司色譜柱的存儲(chǔ)液,如沒(méi)有特殊說(shuō)明均為質(zhì)檢報(bào)告中所述流動(dòng)相,檢測(cè)前,請(qǐng)用相互溶的試劑將其替換。
2) 新色譜柱的平衡:
新反相色譜柱:用純甲醇或者純乙腈沖洗色譜柱30個(gè)柱體積(1個(gè)柱體積=空柱管體積×0.7),再更換成能與檢測(cè)流動(dòng)相互溶的流動(dòng)相沖洗30個(gè)柱體積,zui后用流動(dòng)相穩(wěn)定系統(tǒng)至基線(xiàn)平穩(wěn);
新正相色譜柱:反相使用異丙醇低流速(0.2ml/min)沖洗30個(gè)柱體積;正相使用采用正己烷分析流速?zèng)_洗30個(gè)柱體積,再更換成能與檢測(cè)流動(dòng)相互溶的溶劑沖洗30個(gè)柱體積,zui后用流動(dòng)相沖洗穩(wěn)定系統(tǒng)至基線(xiàn)平穩(wěn)待檢測(cè)。
2. 色譜柱的使用方向:
月旭公司生產(chǎn)的液相色譜柱標(biāo)簽上的箭頭方向?yàn)榱鲃?dòng)相流向,使用過(guò)程時(shí)也按此方向連接出入口,避免雙向混用,導(dǎo)致兩端填料同時(shí)污染,不利于色譜柱的再生和維護(hù)。
3.流動(dòng)相和樣品保持潔凈:
由于懸浮在樣品或流動(dòng)相中的細(xì)小顆粒會(huì)堵塞色譜柱兩端的篩板,各種試劑盡量使用色譜純級(jí)的,用量少的試劑純度至少是分析純,水是超純水和全玻璃器皿雙蒸水,使用前建議用0.45μm的濾膜過(guò)濾;
樣品溶液使用針頭式過(guò)濾器;
樣品中的雜質(zhì)是造成色譜柱污染、柱效下降的zui主要原因之一,復(fù)雜樣品可選樣品預(yù)處理柱(SPE柱)進(jìn)行前處理,如果不方便處理,建議使用與分析柱相匹配的保護(hù)柱。樣品溶劑與流動(dòng)相要相匹配,不能出現(xiàn)樣品溶劑與流動(dòng)相不互溶,極性相差太大等情況,否則會(huì)造成色譜峰形變差、鬼峰等現(xiàn)象,使用流動(dòng)相溶解樣品能有效的避免上述情況發(fā)生。
4.色譜柱允許使用的pH范圍:
每款色譜柱都有自己特定允許使用的pH范圍,請(qǐng)仔細(xì)對(duì)照您的色譜柱的使用pH范圍(表一),在pH范圍以外使用,會(huì)使硅膠基質(zhì)溶解或鍵合相水解,對(duì)色譜柱造成不可恢復(fù)的損傷,如果在臨界pH處使用,分析結(jié)束后立即用適合于色譜柱保存并與當(dāng)前使用的流動(dòng)相互溶的淋洗液置換掉。
色譜柱的保存
短時(shí)間保存:
間隔不超過(guò)四天,色譜柱按平時(shí)維護(hù)程序沖洗至基線(xiàn)平穩(wěn),反相色譜柱保存在不含有緩沖鹽、離子對(duì)試劑的有機(jī)相/水溶液中,有機(jī)相不低于20%;正相色譜柱正相使用保存在純正己烷中,反相使用保存在純有機(jī)溶劑中,并將隨柱的塑料堵頭旋緊密封。
長(zhǎng)期保存:
反相色譜柱保存在80%甲醇或80%乙腈水溶液中;正相色譜柱正相使用保存在純正己烷中,反相使用時(shí)需將柱內(nèi)存儲(chǔ)液用異丙醇置換,zui后用正己烷保存,將色譜柱從儀器上取下,并將隨柱的塑料堵頭旋緊密封。
色譜柱的日常維護(hù)(推薦反向沖洗):
反相使用(包括反相色譜柱和正相色譜柱反相使用)清洗方法:
1) 未使用緩沖鹽,分析完成后用80%甲醇或80%乙腈反向沖洗色譜柱10-20個(gè)柱體積,保存柱子;
2) 使用緩沖鹽,用過(guò)渡流動(dòng)相或者低比例有機(jī)相反向沖洗柱子10-20個(gè)柱體積去除緩沖鹽,用80%甲醇或80%乙腈反向沖洗色譜柱10-20個(gè)柱體積,保存柱子;
3) 使用離子對(duì)試劑,用過(guò)渡流動(dòng)相或者低比例有機(jī)相反向沖洗柱子10-20個(gè)柱體積去除緩沖鹽,再用50%甲醇反向沖洗柱子10個(gè)柱體積,zui后用80%甲醇反向沖洗色譜柱10-20個(gè)柱體積,保存柱子。
正相使用(正相色譜柱正相使用)清洗方法:
分析結(jié)束后,用異丙醇反向沖洗10~20個(gè)柱體積再換正己烷反向沖洗柱子10-20個(gè)柱體積,保存柱子。
色譜柱的異常維護(hù)(按照日常維護(hù)沖洗方向)
1. 柱壓升高
柱壓升高是每個(gè)色譜工作者都很頭疼的問(wèn)題,長(zhǎng)時(shí)間使用造成柱壓的緩慢升高通常是正常現(xiàn)象;短時(shí)間甚至是突然的柱壓升高通常是異常升高,排除儀器的故障,確定是色譜柱自身原因,一般有以下幾點(diǎn):
1) 柱頭的過(guò)濾篩板污染(固體顆粒物堵塞、強(qiáng)保留物質(zhì)累積):
解決方法:
a.在柱前端加上在線(xiàn)過(guò)濾器或保護(hù)柱,用甲醇/水=20/80 1.0ml/min反向沖洗色譜柱180min;
b.在柱前端加上在線(xiàn)過(guò)濾器或保護(hù)柱,反向使用;
c.可將柱頭打開(kāi),將色譜柱頭中過(guò)濾篩板取出,在稀硝酸溶液內(nèi)超聲清洗20min,純水超聲清洗20min,zui后用甲醇超聲清洗20min,重新裝入色譜柱。
2) 柱頭填料污染(固體顆粒物堵塞、強(qiáng)保留物質(zhì)累積):
解決方法:
a.用可以溶解污染物的溶劑較長(zhǎng)時(shí)間(180min)反向沖洗色譜柱;
b.可將柱頭打開(kāi),小心取出被污染的填料,用相同的填料重新裝入修復(fù)。
3) pH使用不當(dāng)造成的損傷:
解決方法:
pH使用不當(dāng)造成固定相的缺失或塌陷,很難使色譜柱恢復(fù),只能更換色譜柱。
2. 推薦使用保護(hù)柱和在線(xiàn)過(guò)濾器:
樣品和流動(dòng)相中不能*過(guò)濾掉及泵磨損、密封圈和管路老化產(chǎn)生的固體顆粒物,進(jìn)入到色譜柱中就會(huì)堵塞篩板,導(dǎo)致柱壓升高,柱效下降,保護(hù)柱和在線(xiàn)過(guò)濾器上都有篩板,孔徑與分析柱的孔徑相同,能阻止顆粒物到達(dá)色譜柱,在分析故障中,柱壓升高占很大比例,因此建議您在色譜柱前端加上在線(xiàn)過(guò)濾器或者保護(hù)柱。
3. 緩沖鹽的正確使用:
緩沖鹽通常易溶于水,難溶于有機(jī)溶劑,其使用不當(dāng)會(huì)析出,加快泵柱塞桿和密封圈,流通閥的磨損,堵塞色譜柱頭篩板,填料基質(zhì)上的微孔和顆粒間的間隙,使填料板結(jié)柱壓升高,阻礙基質(zhì)上鍵合相的碳鏈自由舒展,使色譜柱保留能力下降,柱效降低,縮短其使用壽命,緩沖鹽析出后很難去除,因此正確的使用緩沖鹽對(duì)延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命非常重要,具體方法如下:“使用前過(guò)渡! 使用后沖洗!”
分析前用過(guò)渡流動(dòng)相沖洗柱體積5~10個(gè)柱體積,分析完成后按照色譜柱日常維護(hù)2)項(xiàng)處理;
過(guò)渡流動(dòng)相:有機(jī)相和水相的比例和分析流動(dòng)相中兩相比例一致,或者水相比例高于分析流動(dòng)相,不含緩沖鹽。
緩沖鹽析出處理方案:
1) 方案1:用甲醇/水=10/90以分析速度流速35℃條件下反向沖洗色譜柱40個(gè)柱體積;
2) 方案2:用甲醇/水=10/90以0.2ml/min流速反向沖洗色譜柱過(guò)夜。
4. 避免強(qiáng)保留物質(zhì)在色譜柱保留:
強(qiáng)保留物質(zhì)和大分子化合物在色譜柱中累積,是一個(gè)緩慢的過(guò)程,一段時(shí)間后會(huì)對(duì)樣品成分產(chǎn)生額外的保留行為,引起峰變寬,拖尾,使柱效下降,保留時(shí)間變化,到一定程度時(shí)會(huì)導(dǎo)致柱壓升高,對(duì)許多樣品特別是復(fù)雜樣品很難判斷其是否含有強(qiáng)保留物質(zhì),因此要預(yù)防這一切的方式,堅(jiān)持每天分析完成后用純甲醇或純乙腈反向沖洗色譜柱20個(gè)柱體積以上。但若長(zhǎng)時(shí)間沒(méi)有反向沖洗的柱子,請(qǐng)謹(jǐn)慎反沖。
注意:不要輕易打開(kāi)柱頭,因?yàn)橹^一旦打開(kāi),很難恢復(fù)到新柱的水平,因?yàn)橹^打開(kāi)而造成的檢測(cè)后果,客戶(hù)自行負(fù)責(zé)。
各種鍵合相色譜柱的再生(請(qǐng)慎用)
色譜柱作為液相色譜中昂貴的色譜耗材,會(huì)隨著使用時(shí)間和進(jìn)樣次數(shù)的增加,會(huì)出現(xiàn)異常的色譜現(xiàn)象,如果一根色譜柱的柱效太低或者柱壓太高,通常認(rèn)為該色譜柱使用壽命已到,為了延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命,除了*按照每一款色譜柱的性能使用以外,適當(dāng)?shù)纳V柱再生是很有效的途徑:
1. 氰基(CN)色譜柱的維護(hù)和再生:
CN柱屬于中等極性的固定相,作反相色譜時(shí)操作和維護(hù)和C18柱*相同,增加水相比例,可以促進(jìn)樣品的洗脫,但是CN屬于短鏈的鍵合相,水相比例太高易使CN鍵水解,尤其在色譜柱pH耐受范圍以外,酸性和堿性條件下柱壽命會(huì)下降很快,如果在這個(gè)條件下使用,需要按以下程序用15個(gè)柱體積溶液沖洗,如下:
過(guò)渡流動(dòng)相–95%乙腈并保持95%乙腈繼續(xù)沖洗,以低流0.2mL/min過(guò)夜沖洗;
在pH耐受范圍條件使用時(shí),也比較傷柱子,要注意沖洗,可以參照上述方法,時(shí)間可適當(dāng)減少。CN柱用于正相時(shí),當(dāng)柱子使用一定時(shí)間后,柱效下降,可清洗一下恢復(fù)柱性能,再生時(shí)用10個(gè)柱體積的下列溶液沖洗:氯仿 –異丙醇–二氯甲烷再走流動(dòng)相即可;
CN柱的pH范圍在pH 2.0-8.0。
2. 反相柱的再生:
反相色譜柱是使用zui普遍的色譜柱之一,除按照以上內(nèi)容使用以外,必要的再生清洗可以有效的延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命,用下列每種溶劑20~30個(gè)柱體積沖洗:
100%甲醇–100%乙腈–100%異丙醇–100%二氯甲烷或100%正己烷–100%異丙醇–100%甲醇
3. 正相色譜柱的再生:
正相柱的鍵合官能團(tuán)氨丙基、二羥基丙基等要比C18,C8柱的鍵合官能團(tuán)易水解,所以其使用壽命稍短,特別是使用反相條件時(shí),要嚴(yán)格控制pH值范圍,pH值越低流動(dòng)相中水的比例越高越易發(fā)生水解。
填料被樣品中雜質(zhì)累積污染,色譜柱表現(xiàn)行為柱壓增高柱效降低等,依次用下列程序沖洗柱子:
甲醇–乙腈–異丙醇–氯仿–正己烷–氯仿–異丙醇–甲醇(各以0.5ml/min的流速,20個(gè)柱體積),再換流動(dòng)相。
用氨基柱檢測(cè)酸性物質(zhì)可能會(huì)使略帶負(fù)電荷的氨基官能團(tuán)質(zhì)子化,一定程度上改變對(duì)某類(lèi)的分析物保留性質(zhì)或表現(xiàn)為柱效下降,再生建議是:用5-10個(gè)的柱體積的含0.5-1.0%NH3的50-50乙腈-水溶液沖洗(沖洗后用不含堿的流動(dòng)相洗去多余的氨),分析酸性分析物時(shí)建議在流動(dòng)相中略微添加少許氨如0.1%。
如何改善和提高正相色譜的重現(xiàn)性?
在正相色譜分離模式中,水是一種溶劑強(qiáng)度非常高的溶劑,即便流動(dòng)相中有少量的存在就能對(duì)保留時(shí)間產(chǎn)生強(qiáng)烈的影響,特別是在硅膠或氧化鋁為固定相而使用的流動(dòng)相非極性或疏水性很強(qiáng)的情況下尤
其是這樣。因?yàn)橥闊N類(lèi)溶劑天然含水量極低,基于無(wú)水烷烴的流動(dòng)相,需要很長(zhǎng)時(shí)間才能和環(huán)境中水分達(dá)成平衡。所以,正相色譜柱使用幾天后就觀(guān)察到保留時(shí)間有漂移的現(xiàn)象是司空見(jiàn)慣的??赡苷谴嬖谶@個(gè)令人頭疼的問(wèn)題,成為了當(dāng)今正相色譜沒(méi)有反相色譜那么普及常用的主要原因。有一個(gè)非常有效的改善正相色譜保留時(shí)間重現(xiàn)性的方法:使用和水“半飽和”的正相流動(dòng)相。
“半飽和”流動(dòng)相配置方法:將無(wú)水的非極性流動(dòng)相分成兩半;其中一半中加入一定量水,并混勻攪拌約一小時(shí),靜止分層后,將多余的水相全部除去;將無(wú)水的一半流動(dòng)相和已與水飽和過(guò)的另一半流
動(dòng)相兩部分重新混合在一起,就配成了“半飽和”流動(dòng)相。
正相色譜柱除水:
正相柱一般用的流動(dòng)相是正己烷等非極性溶劑,水是強(qiáng)極性溶劑,正相色譜中用的量很少,水含量稍微一點(diǎn)的小變化,就會(huì)對(duì)出峰時(shí)間有很大的影響,所以正相色譜對(duì)水分含量極敏感。正相填料,硅膠、
氨基、CN基等,本身并無(wú)特殊,也不是碰到水就會(huì)損壞的。隨著時(shí)間的推移,正相填料會(huì)因?yàn)槲搅诉^(guò)多的水分而改性,導(dǎo)致保留能力改變,故需要按使用下列溶劑對(duì)固定相進(jìn)行脫水:
含2.5% 二甲氧基丙烷(dimethoxypropane)和2.5% 冰醋酸的正己烷沖洗30個(gè)柱體積。