1.化學(xué)發(fā)光分析的基本原理

化學(xué)發(fā)光分析含有分析和化學(xué)發(fā)光分析兩個(gè)系統(tǒng)。分析系統(tǒng)是將化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或酶作為標(biāo)記物，直接標(biāo)記在抗原或抗體上，經(jīng)過(guò)抗原與抗體反應(yīng)形成抗原一抗體復(fù)合物。化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是在反應(yīng)結(jié)束后，加入氧化劑或酶的發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)氧化劑的氧化后，形成一個(gè)處于激發(fā)態(tài)的中間體，會(huì)發(fā)射光子釋放能量以回到穩(wěn)定的基態(tài)，發(fā)光強(qiáng)度可以利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物與發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測(cè)物的含量。

2.化學(xué)發(fā)光分析法的類型

化學(xué)發(fā)光分析法根據(jù)標(biāo)記物的不同可分為三大類，即化學(xué)發(fā)光分析、化學(xué)發(fā)光酶分析

和電化學(xué)發(fā)光分析法。

2.1 化學(xué)發(fā)光分析

化學(xué)發(fā)光分析是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體或抗原的一類測(cè)定方法。目前常見(jiàn)的標(biāo)記物主要為魯米諾類和吖啶酯類化學(xué)發(fā)光劑。

2.1.1 魯米諾類標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光分析：魯米諾類物質(zhì)的發(fā)光為氧化反應(yīng)發(fā)光。在堿性溶液中，魯米諾可被許多氧化劑氧化發(fā)光，其中H2o2為常用。因發(fā)光反應(yīng)速度較慢，需添加某些酶類或無(wú)機(jī)催化劑。酶類主要是辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，無(wú)機(jī)類包括O3、鹵素及Fe3 、Cu2 、Co2 和它們的配合物。早期主要用于無(wú)機(jī)物和有機(jī)生物小分子的測(cè)定，靈敏度因標(biāo)記后發(fā)光強(qiáng)度降低而降低。人們發(fā)現(xiàn)發(fā)光體系中加入某些酚類及其衍生物、胺類及其衍生物和苯基硼酸衍生物對(duì)體系的發(fā)光均有作用，發(fā)光強(qiáng)度可1000倍，并且“本底”發(fā)光降低，發(fā)光時(shí)間也得到延長(zhǎng)。這些劑的使用，使化學(xué)發(fā)光分析在蛋白、核酸分析領(lǐng)域得到的應(yīng)用。

2.1.2 吖啶酯類標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光分析：吖啶酯用于CLIA由于熱穩(wěn)定性不是很好，經(jīng)研究合成了更穩(wěn)定的吖啶酯衍生物。在H2o2和OH一條件下，吖啶酯類化合物能迅速發(fā)光，量子產(chǎn)率很高，如吖啶芳香酯的量子產(chǎn)率可達(dá)0.05，吖啶酯作為標(biāo)記物用于分析，發(fā)光體系簡(jiǎn)單、，不需要加入催化劑，且標(biāo)記，本底低。這些特點(diǎn)引起廣大分析診斷工作者的興趣。

2.2 化學(xué)發(fā)光酶分析

化學(xué)發(fā)光酶分析(Chemiluminescent enzymeimmunoassay，cLEIA)屬酶分析，只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，操作步驟與酶免分析*相同：以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP )和堿性磷酸酶(ALP)，它們有各自的發(fā)光底物。HRP常用發(fā)光底物是魯米諾及其衍生物。在CLEIA中，使用過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，進(jìn)行反應(yīng)后，利用魯米諾作為發(fā)光底物，在過(guò)氧化物酶和起動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH和H2o2)作用下魯米諾發(fā)光，酶反應(yīng)物中酶的濃度決定了化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度。此傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光體系(HRP-H2O2-LUMINOL)為幾秒內(nèi)瞬時(shí)閃光，存在發(fā)光強(qiáng)度低、不易測(cè)量等缺點(diǎn)。后來(lái)，在發(fā)光系統(tǒng)中加入發(fā)光劑，以發(fā)光信號(hào)，并在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，便于重復(fù)測(cè)量，從而分析靈敏度和性。

堿性磷酸酶(ALP)已用于酶聯(lián)分析和核酸雜交分析。堿性磷酸酶和1，2．二氧環(huán)乙烷構(gòu)成的發(fā)光體系是目前重要、靈敏的一類化學(xué)發(fā)光體系。這類體系中具有的是ALP-AMPPD發(fā)光體系。在溶液中AMPPD的磷酸酯鍵很穩(wěn)定，非酶催化的水解慢，在pHl2的0.05 mol／L碳酸鈉緩沖溶液中，分解半衰期可達(dá)74年，幾乎沒(méi)有試劑本身的發(fā)光背景。AMPPD為磷酸酯酶的直接發(fā)光底物，可用來(lái)檢測(cè)堿性磷酸酶或抗體、核酸探針及其他配基的結(jié)合物。ALP-AMPPD發(fā)光體系具有高的靈敏度，對(duì)標(biāo)記物ALP的檢測(cè)限達(dá)10-21 mol，是靈敏的測(cè)定方法之一。對(duì)AMPPD加以改進(jìn)，獲得具有反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和更高

靈敏度的產(chǎn)物：CSPD、CDP-Star。這些體系已用于基因和病原體DNA的鑒定。

2.3 電化學(xué)發(fā)光分析

電化學(xué)發(fā)光分析(Electrochemiluminescence，ECL)是指由電化學(xué)反應(yīng)引起的化學(xué)發(fā)光過(guò)程。ECL的反應(yīng)在電極表面進(jìn)行，發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕[Ru(byp)2+3 ]，三丙胺(TPA)用來(lái)激發(fā)光反應(yīng)。在陽(yáng)極表面，兩種物質(zhì)同時(shí)失去電子。在電極板上Ru(byp)2+3 被氧化成Ru(byp)3+3,TPA也被氧化成陽(yáng)離子自由基(TPA+# )，TPA+#自發(fā)地釋放一個(gè)質(zhì)子而變成非穩(wěn)定分子(TPA* )，將一個(gè)電子遞給Ru(byp)3+3，形成激發(fā)態(tài)的Ru(byp)2+3。Ru(byp)3+3在衰減的同時(shí)發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)為620NM的光子，重新回到基態(tài)Ru(byp)2+3。這一過(guò)程在電極表面反復(fù)進(jìn)行，產(chǎn)生、穩(wěn)定的連續(xù)發(fā)光，并不斷。

ECL的突出優(yōu)點(diǎn)是：①標(biāo)記分子小，可實(shí)現(xiàn)多標(biāo)記，標(biāo)記物穩(wěn)定；②發(fā)光時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度高；③光信號(hào)線性好，動(dòng)力學(xué)范圍寬，過(guò)6個(gè)數(shù)量級(jí)；④可重復(fù)測(cè)量，重現(xiàn)性好；⑤可實(shí)現(xiàn)多元檢測(cè)和均相分析；⑥，完成一個(gè)樣品的分析通常18 min；⑦可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化。由于電化學(xué)發(fā)光分析具有性，是一種很有發(fā)展前途的分析法，日益受到人們的重視，目前已應(yīng)用于抗原、半抗原及抗體的檢測(cè)。

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