法醫(yī)DNA實驗室的DNA污染和防范
    法醫(yī)DNA新技術的應用和發(fā)展使得DNA檢驗靈敏度不斷提高,法醫(yī)DNA實驗室的DNA污染問題引起人們關注。為了有效地避免DNA污染,獲得穩(wěn)定、可靠的檢驗結果,法醫(yī)DNA實驗室要建立嚴格的防污染措施和相應的污染監(jiān)測體系來防范DNA污染,一旦發(fā)現(xiàn)DNA污染,還要查找原因,提出解決方案。

1 DNA污染及來源

    DNA污染(DNAcontamination)是指生物物證檢材在提取或檢驗過程中混有含DNA的外源生物物質,造成DNA檢驗的結果發(fā)生改變。DNA污染屬于物證污染的一種,但與其它的污染有所不同。由于目前常用的法醫(yī)DNA技術是針對現(xiàn)場提取到的、與人有關的各種生物物證進行檢驗,具有人的種屬特異性(humanspecies2specific),這里提到的外源DNA(exogenousDNA)一般特指人基因組DNA,而不是其它的非人DNA。在生物物證檢材保存過程中如果保存方法不當,樣本中存在的微生物DNA等非人DNA,可能會造成物證DNA的降解,從而影響檢驗結果,但是在實驗室內利用現(xiàn)有的DNA檢驗方法檢測不到非人DNA,不會造成DNA污染。

    法醫(yī)DNA實驗室中的外源DNA有3個來源[3]:

    1)檢驗技術人員的DNA;

    2)實驗室其它樣本中含有的DNA;

    3)檢驗過程中的PCR擴增產物或等位基因標準對照物(allelicladder)。由實驗室內技術人員自己的DNA引起的DNA污染稱作自身污染(selfcontamination),多是由于操作人員在檢驗過程中的疏忽造成;由實驗室內其它樣本DNA引起的DNA污染稱作交叉污染(crosscontamination),多是由于檢材保管或提取DNA時操作不當造成;由PCR擴增產物或等位基因標準對照物引起的DNA污染稱作PCR污染(PCRcontamination),多是由于實驗室設計、管理或操作不當造成。

    當技術人員自身的DNA在實驗室用具或消耗品等物品上時,自身污染也可以是通過交叉污染的方式造成(PCR污染也是同樣)。

2 實驗室防污染措施

    每個人在日常生活中都被DNA包圍著,人的任何活動都有可能留下DNA,對DNA檢驗造成污染。有些DNA污染,能夠通過重新的檢驗加以糾正,而有些污染(如對極少量物證檢材的污染)則可能造成不可彌補的損失,所以對于DNA污染,法醫(yī)DNA實驗室要重在預防,建立一整套完善的防污染的制度,

并嚴格貫徹執(zhí)行。

2.1 實驗室的環(huán)境和設施

    法醫(yī)DNA實驗室對環(huán)境和設施嚴格控制,實行分區(qū)域管理和定期清潔制度,是避免DNA污染的有效手段。

2.1.1 實驗室分區(qū) 由于法醫(yī)DNA檢驗的高靈敏性,為了防止檢驗過程中的交叉污染,法醫(yī)DNA實驗室應建立實驗室分區(qū)和*進入制度,各區(qū)域間的通風、排氣系統(tǒng)不得混用,無關人員不得進入實驗區(qū)域,不同區(qū)域的實驗設備及器械不得混用。

    DNA實驗室的分區(qū)域管理,能夠保證在不同的實驗區(qū)域內完成不同的檢驗,按照DNA含量由少到多的順序,實現(xiàn)檢材和樣本的單方向流動。DNA實驗室必須設置案件受理和檢材保管區(qū)、樣品DNA提取區(qū)、DNA擴增區(qū)、DNA檢測區(qū)[4],有條件的實驗室還應設置初檢區(qū)、結果分析區(qū)、準備區(qū)等,其中DNA擴增區(qū)和檢測區(qū)還應設置緩沖區(qū),供技術人員更換工作服。對于微量DNA的檢驗,如接觸DNA等,由于檢材含有的DNA量少,更存在污染的危險,要設置專門的DNA提取區(qū)域。

    PCR污染是法醫(yī)DNA實驗室的特點,也是實驗室污染防范的重點。在PCR擴增產物或等位基因標準對照物中含有高濃度的DNA目的片段,極少的量就會被檢測到,實驗室一旦發(fā)生此類污染,將很難清除,后果嚴重。對實驗室實行分區(qū)管理,嚴格按要求操作,能夠有效地預防污染發(fā)生,其中重點要對DNA檢測區(qū)進行嚴格管理。含有擴增產物或對照物的離心管只能在DNA檢測區(qū)打開,不允許帶出該區(qū)域;處理檢測區(qū)的廢物時要封裝嚴密;技術人員進出該區(qū)域要更換工作服。

2.1.2 實驗室清潔 做好實驗室的清潔工作是防止DNA實驗室內發(fā)生交叉污染的有效途徑。造成DNA交叉污染的原因多種多樣,主要是物證檢材之間或比對樣本與物證檢材之間的相互污染。DNA交叉污染的方式可以是直接接觸造成,也可以是通過一定的載體使外源DNA發(fā)生轉移造成,使DNA檢驗結果錯誤;前者容易發(fā)現(xiàn)和預防,后者則較難發(fā)現(xiàn)和預防,這要求實驗室要做到定期清潔和消毒。

    實驗室的清潔范圍包括對工作臺面、儀器設備表面、重復使用的工具或器皿等的清潔。工作臺面重點部位包括實驗室受理檢材的柜臺、DNA提取工作臺、吸取DNA的超凈臺和檢材存儲柜等都是容易接觸并DNA的區(qū)域;儀器設備主要有離心機的轉頭、提取DNA用的加熱塊、擴增儀的樣品槽、移液器桿的吸孔、遺傳分析儀的加樣槽等;重復使用的工具或器皿主要有剪取檢材樣本使用的剪刀及鑷子、配制試劑所用的試劑瓶等。

    實驗室清潔主要是采用擦拭清洗的辦法,先用新鮮配制的10%漂白液(7mM次氯酸鈉溶液)將需要清理物體的表面反復擦拭,再用75%乙醇擦洗以去除殘留物,可以有效清除它們表面附著的各種污染物,條件允許的情況下定時進行紫外燈照射消毒[5]。實驗室除要建立定期清潔制度外,一旦發(fā)現(xiàn)在檢驗過程中有可能發(fā)生DNA污染時,要及時清理和清潔。

2.2 技術人員的操作

    在各種情況下,實驗結果的準確、可靠,先要依賴于實驗室內技術人員的操作,應該說技術人員是影響DNA鑒定結果的主要因素。技術人員在進行DNA檢驗的過程中要時刻樹立防污染的意識,警惕任何可能造成DNA污染的操作和步驟,嚴格按照操作要求進行檢驗,才能達到防止污染的目的。2.2.1 個人防護

    法醫(yī)DNA實驗室內技術人員說話或咳嗽時飛濺的唾液、脫落的頭皮屑等含有大量的DNA,在實驗過程中都可能造成自身DNA的污染,所以技術人員要采取個人保護措施,防止污染發(fā)生。由于DNA檢驗技術人員本身在檢驗過程中不注意或操作不當造成的DNA污染并不少見。2004年,美國華盛頓犯罪實驗室在調查23起DNA檢驗造成錯誤鑒定的原因時,發(fā)現(xiàn)其中8起案件是由于技術人員自身DNA污染造成,另有8起由于DNA交叉污染造成[6]。

    DNA實驗室內技術人員在檢材交接、保存、初檢及提取DNA時,必須穿戴好實驗室工作服、一次性手套、面罩(或口罩)、發(fā)罩(或帽子);進行其它檢驗操作時,也必須穿工作服、戴手套,進出DNA擴增區(qū)及檢測區(qū)時,還應在緩沖區(qū)更換工作服,防止空氣中含有擴增產物的氣溶膠顆粒被帶入其它區(qū)域造成污染。

2.2.2 器具和消耗材料的使用

    DNA檢驗使用的各種器具和消耗材料都有可能是攜帶外源DNA的載體,操作中如果不慎會造成DNA污染。實驗過程中,要盡量使用一次性用品或器具,其中包括手套、移液用的吸頭、離心管等;使用的手套在接觸可能含有DNA的物品后要及時更換,當打電話、觸摸計算機鍵盤等時要除去手套;重復使用的器具,如剪刀、鑷子等,處理物證檢材后要及時更換;實驗區(qū)內備用的離心管、吸頭、剪刀、鑷子、干凈的棉簽拭子等用具要封裝嚴密;為了防止移液器頭部的DNA污染,還可以使用防止氣霧的吸頭(aero2solresistanttip)。

2.2.3 DNA提取

    從檢材樣本中提取DNA是DNA檢驗的開始,也是容易造成DNA自身污染和交叉污染的步驟。為了避免DNA污染,現(xiàn)場提取物證檢材和比對樣本提取DNA時要分開在不同區(qū)域操作,對于不具備條件的實驗室,也要分開在不同時間分別提取物證檢材和比對樣本DNA;處理物證檢材時,不要把多件檢材放在一起,一次只應處理一件物證檢材,不要把檢材直接放在工作臺面上,每次都要放置新的襯紙墊,做到及時更換襯紙墊和手套;提取DNA時,先處理檢材DNA含量少的物證,再處理檢材DNA含量多的物證,

防止造成DNA量少的物證檢材的污染。

2.2.4 DNA擴增和檢測

    DNA擴增和產物檢測的過程中要注意避免PCR污染的產生。擴增時,由于樣品多,要注意不要加錯樣,把已加樣完的樣品移離原來的位置,與未加樣樣品分開,可以防止此類錯誤,有條件的實驗室,可使用自動化工作站;打開含有DNA的離心管前要在離心機中瞬時離心,以使溶液處于管底,防止開蓋時溶液滲出或飛濺;DNA檢測區(qū)的一切物品,尤其是含擴增產物的離心管嚴禁帶入DNA提取區(qū)和擴增區(qū)。

2.3 試劑及消耗品的防污染質量控制

    法醫(yī)DNA實驗室所使用的試劑及消耗品的質量能否滿足要求是保證DNA檢驗結果準確的基礎。2002年,英國法庭科學服務中心(FSS)的DNA實驗室在DNA檢驗中曾因離心管被生產工人的DNA污染而導致錯誤地串并數(shù)起刑事案件,誤導了案件的調查[7],使我們認識到質量控制(qualitycontrol,QC)的重要性。

    DNA實驗室為了在檢驗中獲得準確、可靠的結果,在關鍵試劑和消耗材料使用前要對其進行質量控制檢驗,確認其指標合格后才能用于DNA檢驗。DNA實驗室的關鍵試劑主要是指DNA純化試劑盒和STR復合擴增試劑盒,關鍵消耗材料是指離心管、吸頭、棉簽拭子等。對于不同批次的試劑或消耗材料,必須對每一批次分別進行質控檢驗;對于同一批次的試劑或消耗材料只需對隨機抽取的樣品進行質控檢驗。質控檢驗是用質控對象分別對已知DNA分型的陽性對照(posi2tivecontrol)和不含DNA的陰性對照(negativecontrol)進行DNA檢驗,如果陽性對照的結果分型正確,陰性對照的結果不含譜帶,就表明質控對象合格。質控合格的試劑或消耗材料要標記質控日期和有效期,再用于DNA檢驗。

3 實驗室DNA污染監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)

    DNA實驗室一旦發(fā)生DNA污染,就會產生錯誤的結論,這就要求實驗室要有一套監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)DNA污染的措施,通常采取設置對照樣本、核查DNA圖譜質量、建立DNA排查庫等辦法加以解決[8]。值得一提的是這些檢測污染的方法起不到預防DNA污染的作用,只是能夠發(fā)現(xiàn)檢驗過程中存在的一些污染,但不能夠發(fā)現(xiàn)所有的DNA污染。

3.1 設置對照樣本

    在DNA檢驗過程中,平行設置不同類型對照樣本的檢驗,根據檢驗結果來判斷在操作中是否存在DNA污染,是對法醫(yī)DNA實驗室DNA污染進行監(jiān)測的好方法,實驗室的技術人員必須按照要求進行操作。2002年,美國的聯(lián)邦調查局(FBI)的DNA實驗室發(fā)生的技術人員未按照操作規(guī)范進行陰性對照檢驗,無法確定在檢驗過程中是否有DNA污染的存在,導致百余起案件重新鑒定,一些DNA結果從DNA數(shù)據庫中被刪除,一些物證檢材因沒有檢驗條

件而無法做出鑒定結論,嚴重影響了FBI的聲譽[9]。

    DNA檢驗中設置的對照樣本有陰性對照和陽性對照兩種。

3.1.1 陰性對照

    陰性對照,又稱空白對照(blankcontrol),是指平行實驗中設置的不含DNA

樣品的檢驗,主要有PCR陰性對照、試劑空白對照和檢材空白對照三種。PCR陰性對照是在PCR反應時用水代替模板DNA進行反應的對照,主要用于監(jiān)測PCR反應體系和PCR檢驗過程中DNA污染情況;試劑空白對照是使用所有檢驗試劑平行對空白樣品進行檢驗的對照,主要用于監(jiān)測檢驗全過程所用試劑的DNA污染情況;檢材空白對照是對空白檢材的載體樣本(不含檢材斑跡的載體)進行平行檢驗的對照,主要用于監(jiān)測載體樣本的DNA污染情況,這在ABO血型等檢驗中常用,在DNA檢驗中較少用。陰性對照的檢驗結果應該沒有DNA譜帶,一旦發(fā)現(xiàn)結果中有譜帶出現(xiàn),就表明有DNA污染的存在。

    陰性對照可以監(jiān)測檢驗中發(fā)生的系統(tǒng)污染,但對于發(fā)生在特定樣品檢驗中的偶然污染無能為力,還要靠其它的監(jiān)測辦法。

3.1.2 陽性對照

    陽性對照是指在平行實驗中設置已知分型的DNA樣本,主要用于監(jiān)測DNA分型結果的可靠性和準確性。用于陽性對照的DNA樣本可以使用參考標準物質,如A9947或K562等[10],也可以使用實驗室中已知分型的自制DNA樣本。當陽性對照的檢驗結果產生多余的等位基因時,表明有DNA污染的存在。

3.2 核查DNA圖譜質量

    核查DNA檢驗結果的圖譜質量是發(fā)現(xiàn)是否存在DNA污染的又一方法。核查DNA圖譜的方法主要是看DNA結果中是否有多余的譜帶或明顯不符合邏輯的結果。以下幾種情況值得注意:

1)對于等位基因標準對照物污染的情況比較容易發(fā)現(xiàn),在某一或某些基因座的分型結果中如果包含的等位基因如同Ladder一樣,就要考慮可能發(fā)生Ladder的污染。

    這是實驗室中發(fā)生的比較嚴重的一類污染,一般多發(fā)生在PCR反應的操作中。

2)對于已知嫌疑人的比對樣本,只應該是一個人的DNA圖譜,如果結果中發(fā)現(xiàn)有明顯多余的譜帶存在,就要考慮有DNA污染的發(fā)生。

3)當核查DNA圖譜時,如果發(fā)現(xiàn)人員樣本與DNA檢驗結果在性別上不同時,要加以注意是否存在DNA污染或弄錯樣本編號的情況。

4)在DNA檢驗結果中,不是只要有多余的譜帶都是由于DNA污染造成的,有些多余譜帶是與生物技術或檢測技術相關的,如影子帶(stutter)、加A不*、熒光洇滲(pull2up)、模板量太多等造成,要注意加以區(qū)別和分析[11]。5)陰性對照發(fā)生污染時,要注意核查檢驗樣本的DNA分型是否含有陰性對照污染的等位基因。

3.3 DNA數(shù)據庫的檢索比對

    DNA檢驗結果的數(shù)字化使得DNA數(shù)據庫的建設發(fā)展迅速,利用DNA數(shù)據庫的自動比對功能,把DNA實驗室獲得的所有DNA分型進行數(shù)據庫管理,可以發(fā)現(xiàn)DNA實驗室中可能存在的一些污染。

3.3.1 DNA排查數(shù)據庫

    DNA排查數(shù)據庫(elim2inationdatabase)是儲存需要排除的相關人員DNA分型的數(shù)據庫,用于監(jiān)測和發(fā)現(xiàn)DNA檢驗結果是否受到相關的現(xiàn)場或實驗室人員污染。英國的DNA數(shù)據庫(NDNAD)是世界上早、大、發(fā)揮作用數(shù)據庫,其中建立了現(xiàn)場警員排除庫(PED)、實驗室人員排除庫(SED)和耗材生產人員排除庫(MED),用于檢查實驗室的DNA檢驗結果是否受到相關人員的污染[12]。許多DNA實驗室都建立技術人員的DNA分型數(shù)據庫,用于檢測技術人員自身的DNA污染,但是在國內,目前還未建立現(xiàn)場勘查人員和耗材生產人員的DNA排查庫,無法對這些人員進行排查,只在特殊案件的檢驗結果中才會考慮進行個案排查。

3.3.2 同批次樣本間的比對

    DNA交叉污染和樣品

    編號混淆也是DNA實驗室中偶爾發(fā)生的問題,對同批次檢驗樣本間的DNA分型結果進行比對可以用來發(fā)現(xiàn)此類錯誤。英國FSS使用的I23分析管理軟件就具有這一功能,對同批次檢驗的DNA結果相互比對,發(fā)現(xiàn)可疑的比中記錄后進行認真的核查來確定每次檢驗的大量樣本間是否存在交叉污染的情況。對于國內的DNA實驗室,可以在出具鑒定結論之間,將DNA分型先錄入DNA數(shù)據庫進行自動比對,如果發(fā)現(xiàn)DNA分型相同的樣本來自同批次檢驗,且前期沒有相互關聯(lián)的信息,就要進行認真的核查。

4 DNA污染的糾正

    DNA污染的結果會影響DNA鑒定的質量,降低鑒定結果證據價值,嚴重時會造成鑒定結論錯誤,產生錯案。DNA實驗室一旦發(fā)現(xiàn)有DNA污染的存在,就要認真查找污染源,分析造成的原因,提出解決方案,同時還要對這一時期獲得的DNA數(shù)據進行復核,查找是否存在未被發(fā)現(xiàn)的污染情況。

    DNA實驗室在查找污染原因時,可以設計一系列的陰性對照試驗對檢驗過程中使用的所有試劑逐一進行排查,丟棄發(fā)現(xiàn)有問題的試劑;也有的實驗室為了方便,丟棄污染時所有使用過的試劑,重新配制新試劑進行檢驗。DNA污染發(fā)生后,還要清潔所有的工作臺面和儀器設備表面。

    當DNA實驗室發(fā)生的PCR污染不是由于試劑原因造成,結果又難以解釋時,要考慮PCR產物形成氣溶膠造成污染的情況,這類污染往往難于去除。小的DNA分子達到一定數(shù)量時很可能會包含在氣溶膠的顆粒上,污染DNA擴增區(qū)域的環(huán)境,從而造成PCR污染。實驗室一旦發(fā)生PCR污染,要對擴增區(qū)采取清潔臺面、通風透氣、紫外照射等辦法進行*地處理,一般所需時間較長,會對DNA鑒定工作產生影響。為了不影響工作,必要時可在DNA實驗室之外的其它實驗室進行DNA擴增。

    當對DNA鑒定結論產生懷疑時,條件允許的情況下可以采用重新檢驗的方法進行驗證,這是糾正DNA污染的另一方法。當兩次檢驗的結果相同時,應該認為DNA結果是可靠的;當兩次結果不同時,要認真分析原因后再考慮進一步采取的措施。如果是同一個體來源的樣本出現(xiàn)兩次結果的不同,則肯定有錯誤發(fā)生;如果發(fā)生在現(xiàn)場提取的物證檢材上,由于DNA檢驗對檢材是消耗性的,則要分析檢材上是否存在不同來源的DNA。

    DNA污染是產生DNA鑒定結論錯誤的重要因素,法醫(yī)DNA實驗室要努力去解決這一問題。但是,DNA污染不僅發(fā)生在DNA實驗室的檢驗環(huán)節(jié),還有可能發(fā)生在物證檢材的提取過程中,也有可能發(fā)生在用其它物證技術對物證檢材進行檢驗之時。所以,隨著法醫(yī)DNA技術的廣泛應用,對DNA污染的防范不單是DNA檢驗人員的職責,而是所有法庭科學技術人員共同的責任,應引起高度重視,以使現(xiàn)場提取到的物證檢材發(fā)揮應有的價值。