快速分析中色譜柱的選擇 系列攻略之關于流動相的置換速度

近年來，在液相色譜分析領域，“快速分析”的話題越來越多被提起。

在2020年版《中國藥典編制大綱》中，也提到“積極倡導綠色標準和經(jīng)濟標準，推廣采用毒性小、污染少、節(jié)約資源、保護環(huán)境、簡便實用的檢測方法”。

我們總結(jié)了一系列快速分析中色譜柱的選擇攻略，這是后一篇啦~沒看過前面的老師可以點擊文字標題查看喲~↓↓↓

★ 快速分析時的關鍵因素

：關于粒徑（點擊查看）

第二彈：關于流速與柱壓（點擊查看）

★ 快速分析時色譜柱特性的關鍵點

第三彈：填充技術與高流*果（點擊查看）

第四彈：色譜柱的化學性質(zhì)（點擊查看）

第五彈：關于流動相的置換速度

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流動相的置換速度

設定好的流動相條件在色譜柱中的置換速度對快速分析來說至關重要。

全多孔型填料的保留能力及負載量都很優(yōu)秀，但細孔內(nèi)的擴散會導致色譜柱內(nèi)的液體組成變化需要一定的時間。

如下圖所示，當填料粒徑縮小時，在構(gòu)造上，由于擴散帶來的液體置換范圍變窄，因此液體置換速度更快——在進行梯度條件的多組分分析時，流動相的置換速度將對分析結(jié)果產(chǎn)生很大影響。

▲ 不同尺寸填料粒子的擴散情況

下面，將通過展示一個肽譜分析數(shù)據(jù)例，說明不同粒徑尺寸對于流動相置換速度的影響。

如下圖，分別使用5 μm的MGIII和2 μm的IF柱，在40分鐘的梯度條件下對人血白蛋白胰蛋白酶分解物進行分析。

IF柱所得結(jié)果與MGIII相比，各色譜峰之間的整體分離度未見明顯提升，反而由于小粒徑導致高柱壓，*沒有體現(xiàn)出小粒徑色譜柱的優(yōu)勢。這是因為填料粒子表面在平緩的梯度條件下，由于擴散作用導致流動相置換速度變慢，因此填料粒徑所帶來分離性能上的差別未能在結(jié)果中體現(xiàn)出來。

▲ 一般梯度條件下人血白蛋白胰蛋白酶分解物的分析結(jié)果

流動相：A) 0.05 vol% TFA水溶液

             B) 0.05 vol% TFA乙腈水溶液

           B  2% （0.0 min）-> 50% (40 min) -> 2% (40 min) -> 2% (43 min)

流　速：200 μL/ min

檢測器：UV 210 nm

樣　品：人血白蛋白胰蛋白酶分解物

進樣量：2 μL

如下圖，在8分鐘的快速梯度分析結(jié)果中，則體現(xiàn)了粒徑差異對分析的顯著影響：

▲ 快速梯度條件下人血白蛋白胰蛋白酶分解物的分析結(jié)果

流動相：A) 0.05 vol% TFA水溶液

             B) 0.05 vol% TFA乙腈水溶液

           B  2% （0.0 min）-> 50% (8 min) -> 2% (8 min) -> 2% (10 min)

流　速：200 μL/ min

檢測器：UV 210 nm

樣　品：人血白蛋白胰蛋白酶分解物

進樣量：2 μL

粒徑5 μm的MGIII填料粒子周圍的液體組成變化和細孔內(nèi)的液體置換之間出現(xiàn)延遲，因此出現(xiàn)了峰形變差的現(xiàn)象；

與此相對，粒徑2 μm的IF柱的分析結(jié)果與40分鐘結(jié)果相比，雖然分離度有所降低，但比5 μm柱所得峰形更尖銳，這就是填料內(nèi)部液體置換迅速所帶來的好處。