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HPLC 和 UHPLC之間的方法轉(zhuǎn)換
我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中經(jīng)常遇到這樣的問(wèn)題：
實(shí)驗(yàn)室新買(mǎi)了UHPLC,想要將原來(lái)的HPLC方法轉(zhuǎn)移到新的機(jī)器上,卻不知道該怎么著手？
在文獻(xiàn)中查找到一個(gè)UHPLC建立的快速分析方法，如何將這個(gè)方法轉(zhuǎn)移到僅有HPLC的實(shí)驗(yàn)室呢？
今天來(lái)為大家講一講，HPLC和UHPLC之間的方法轉(zhuǎn)換時(shí)應(yīng)該注意哪些問(wèn)題？怎樣來(lái)選擇合適的色譜柱？
主要內(nèi)容
1. 方法轉(zhuǎn)換中的不可變條件
2. 方法轉(zhuǎn)換中的變化條件
3. 方法轉(zhuǎn)換中的基本調(diào)整規(guī)則
1. 方法轉(zhuǎn)換中的不可變條件
在方法轉(zhuǎn)換的時(shí)候，為了達(dá)到良好的分離情況，我們應(yīng)該盡可能保持與HPLC分析方法中的主要分離條件一致。
(1) 在色譜柱中使用填料的性質(zhì)和選擇性應(yīng)當(dāng)相同。
(2) 使用的流動(dòng)相組成（強(qiáng)洗脫有機(jī)溶劑、緩沖物組成、pH等）應(yīng)該相同。
(3) 檢測(cè)器的工作條件（檢測(cè)波長(zhǎng)）應(yīng)該相同。
(4) 柱溫應(yīng)當(dāng)相同。
2. 方法轉(zhuǎn)換中的變化條件
方法轉(zhuǎn)換的過(guò)程中，通常是通過(guò)更換與UHPLC系統(tǒng)相匹配的，具有相同分離性能的色譜柱規(guī)格，調(diào)整流速來(lái)提高分離效率。
以下幾點(diǎn)是我們需要特別注意的地方。
(1) 填料的粒徑由大變小。
(2) 色譜柱的內(nèi)徑由寬變窄。
(3) 色譜柱的長(zhǎng)度由長(zhǎng)變短。
(4) 色譜柱的壓力降由低變高。
(5) 色譜儀系統(tǒng)的死體積和梯度滯留體積由大變小。
(6) 流動(dòng)相的流速由大變小。
(7) 洗脫時(shí)間由長(zhǎng)變短。
3. 方法轉(zhuǎn)換中的基本調(diào)整規(guī)則
現(xiàn)在，大家已經(jīng)了解 HPLC→UHPLC 方法轉(zhuǎn)換時(shí)應(yīng)該注意的可變條件和不可變條件了，那么具體怎么操作呢？
下面讓我們通過(guò)一個(gè)例子來(lái)掌握這項(xiàng)實(shí)用的工作技能吧。
例如，一個(gè)HPLC分析方法，使用色譜柱的規(guī)格是 4.6mm×250mm×5um；流速為1mL/min,柱壓為10Mpa,進(jìn)樣體積為10uL.
那么，如果換成粒徑為2um的UHPLC柱，柱長(zhǎng)、流速、壓力、進(jìn)樣量該如何來(lái)選擇呢？
我們可以按照下面的步驟逐步來(lái)計(jì)算：
調(diào)整步驟
柱長(zhǎng)、粒徑的選擇
流速的調(diào)整
色譜柱的壓力
進(jìn)樣量的調(diào)整
（1）色譜柱規(guī)格的調(diào)整
首先引入一個(gè)分離效能的概念：
Se=L/dp
式中，L為色譜柱的柱長(zhǎng),mm;dp為色譜柱粒徑,um。
對(duì)于不同的色譜柱，只要能保持柱長(zhǎng)和粒徑的比值相同，那么分離效果就是差不多的。
柱長(zhǎng)的計(jì)算：
L2=L1×(dp2/dp1)
L2=250×(2/5)mm=100mm
根據(jù)以上計(jì)算結(jié)果，我們就可以選擇規(guī)格為2.1mm×100mm×2um的CAPCELL PAK IF2 色譜柱了。
（2）流速的調(diào)整
我們還是利用上面這個(gè)例子，現(xiàn)在規(guī)格選好了，那么流速設(shè)置多少更合適呢？
流速的計(jì)算：
式中，F(xiàn)為流速，dc為色譜柱內(nèi)徑，dp為填料的粒徑。
F2=1×(2.1/4.6)×(2.1/4.6)×(5/2)mL/min=0.52mL/min
根據(jù)以上計(jì)算結(jié)果，我們可以將流速設(shè)置為0.52mL/min.
（3）色譜柱的壓力
柱壓的計(jì)算一般使用下面的公式：
按上述計(jì)算方法，確定色譜柱規(guī)格和流速以后，在估算色譜柱的壓力時(shí)，可以僅考慮填料粒徑的影響，近似式為
式中，p為柱壓。
p2=10×(5/2)×(5/2)Mpa=62.5Mpa
CAPCELL PAK IF2 具有超高的耐壓性能，耐壓可達(dá)100Mpa，*符合替換要求。
（4）進(jìn)樣量的調(diào)整
對(duì)進(jìn)樣量的計(jì)算：
式中：Vinj 為進(jìn)樣量。
V2=10×(2.1/4.6)×(2.1/4.6)×(100/250)=0.83uL
在這里留個(gè)思考題：
色譜柱規(guī)格變化之后，為什么要調(diào)整進(jìn)樣量呢？
您可以根據(jù)自己試驗(yàn)的實(shí)際情況或檢測(cè)限的要求來(lái)調(diào)整進(jìn)樣量。
這個(gè)開(kāi)始看似很復(fù)雜的方法轉(zhuǎn)換問(wèn)題，經(jīng)過(guò)我們一步一步地計(jì)算，是不是變得很簡(jiǎn)單了呢？
HPLC→UHPLC的轉(zhuǎn)換結(jié)果
如果您現(xiàn)在正好有HPLC的項(xiàng)目，可以自己嘗試轉(zhuǎn)化成UHPLC方法，不僅可以提高分離效率，還能省下不少試劑呢！