細胞傳代培養(yǎng)是細胞培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一，也是幾乎所有細胞生物學(xué)實驗的基礎(chǔ)。當(dāng)細胞隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞不斷分裂，細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止，且也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于細胞生長或發(fā)生中毒。因此，細胞在培養(yǎng)瓶中長滿后就需要將其稀釋，分種成多瓶，細胞才能繼續(xù)生長。這一過程就叫傳代。

細胞傳代作為一種常規(guī)的實驗操作，不但可以擴大細胞培養(yǎng)的數(shù)量，同時也可以避免細胞因進入平臺期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。所以為了讓細胞保持在對數(shù)生長期，維持細胞旺盛的分裂能力，這時候就需要進行細胞傳代。

細胞傳代要在嚴(yán)格的無菌條件下進行，并且根據(jù)不同細胞采取不同的方法：

? 貼壁生長的細胞用消化法傳代；

? 部分貼壁生長但貼壁不牢固的細胞可以采用直接吹打傳代；

? 懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心沉淀后再分離傳代，或直接用自然沉淀法吸除上清后，再吹打傳代。

上次講了細胞復(fù)蘇操作，今天來講講細胞傳代的操作（適用于貼壁細胞的傳代培養(yǎng)）！

細胞復(fù)蘇流程圖

細胞傳代流程圖

01

細胞傳代前準(zhǔn)備

? 實驗開始前，將15mL離心管、移液管、槍頭等實驗需要用到的耗材放入無菌超凈工作臺，紫外線照射30min。

? 將*培養(yǎng)基、PBS、胰酶預(yù)熱至37℃。

? 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長密度，當(dāng)細胞生長密度達到80%~90%匯合度即可進行傳代。

02

胰蛋白酶/EDTA消化

? 棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗去殘留的舊培養(yǎng)基，重復(fù)洗兩次。

注意：

貼壁加入到培養(yǎng)皿的邊緣，不能直接對著細胞加入PBS，容易把細胞都吹起來。這一步的目的是為了去掉殘余的培養(yǎng)基，殘余的培養(yǎng)基會含有血清和一些離子等，不利于接下來的消化。

? 棄去PBS，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA（T25培養(yǎng)瓶加入約1.5mL，T75培養(yǎng)瓶加入約3mL），迅速鋪勻，保證充分接觸細胞表面（消化時間視具體細胞而定）。

? 顯微鏡下觀察消化情況，約70%~80%細胞收縮變圓后，輕拍培養(yǎng)容器外壁，使細胞脫離培養(yǎng)表面。立即加入2倍胰酶量的*培養(yǎng)基輕搖培養(yǎng)容器，使培養(yǎng)基和胰酶迅速混勻，終止消化。

? 使用吸管或移液管輕輕吹打細胞表面，吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次，盡可能將細胞都吹打下來。

注意：

吹打動作不可劇烈，避免產(chǎn)生大量氣泡，否則可能損傷和損失細胞。

? 取所有細胞懸液放入無菌15mL離心管內(nèi)，250×g，室溫離心4min。

03

細胞培養(yǎng)

? 離心后去除上清。加入適量*培養(yǎng)基，輕柔吹打細胞沉淀，充分吹散、混勻，計數(shù)。將細胞按(2.5~4)×104個活細胞/cm2接種至適宜的培養(yǎng)容器內(nèi)。

? 搖勻細胞，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中。

? 傳代次日，觀察細胞狀態(tài)。若發(fā)現(xiàn)較多漂浮細胞，應(yīng)予以換液。

? 待細胞生長至80%~90%匯合度，即需傳代或凍存。

注意事項

胰酶濃度

推薦胰酶使用濃度為0.25%-0.04%EDTA，使用之前需預(yù)熱至37℃且pH值應(yīng)維持在7.2左右。切忌消化過度（包括胰酶濃度過高、消化時間過長等），否則會導(dǎo)致細胞死亡、分化、狀態(tài)變差，分化能力丟失等現(xiàn)象。細胞消化過程中需要在顯微鏡下觀察細胞的消化程度，當(dāng)看到大部分細胞變圓不貼壁，拍打培養(yǎng)瓶兩側(cè)會有大量細胞脫落，此時應(yīng)立即終止消化；若細胞仍有大部分貼壁，可適當(dāng)延長消化時間以避免消化不*的情況出現(xiàn)。

細胞的差異

不同種類的干細胞差異很大，特別是與腫瘤細胞株的差異更大，很多經(jīng)驗不可以直接使用，消化時需要仔細摸索最佳的時間。

接種密度

干細胞傳代過程中接種密度至關(guān)重要，如果太低會導(dǎo)致細胞增殖緩慢，甚至導(dǎo)致細胞老化，而細胞的老化是不可逆轉(zhuǎn)的。一般細胞接種密度為20000個活細胞/cm2即5×105個活細胞/T25，不同的干細胞接種密度會稍有差異，比如hMSC，我們推薦的傳代接種比例為1:2。

吹打細胞動作要輕柔

吹打動作不可劇烈，避免產(chǎn)生大量氣泡，否則可能損傷和損失細胞。