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細胞轉染實驗中常見問題

時間:2023-5-15閱讀:820

一、轉染效率低

影響轉染效率因素很多,主要因素有細胞培養(yǎng)物、血清、載體構建、DNA質量以及轉染技術等。

1.沒有使用優(yōu)化條件:優(yōu)化陽離子脂質體試劑和DNA的量。

2.DNA-陽離子脂質體試劑復合物在存在血清條件下形成。

3.存在抑制劑:不要在用于制備DNA-陽離子脂質體復合物的培養(yǎng)基中使用抗生素,EDTA,檸檬酸鹽,磷酸鹽,RPMI,硫酸軟骨素。透明質酸,硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。

4.不恰當的細胞密度:轉染時融合度應為70%-90%。

5.陽離子脂質體試劑凍結:不要使用凍結的或儲存溫度低于4℃的陽離子脂質體試劑。

6.質粒純化的問題。

二、細胞死亡率高

1.DNA量太高

2.陽離子脂質體試劑量太高

3.在轉染過程中使用抗菌素:在轉染過程中不要使用氯霉素,青霉素或鏈霉素,因為陽離子脂質體試劑使細胞更敏感。

4.細胞太少

5.在無血清條件下細胞活性降低:使用OPTI-MEM培養(yǎng)基。確保在不存在血清的條件下形成復合物。

6.陽離子脂質體試劑被氧化:不要過分攪動或振蕩陽離子脂質體試劑,這可能會形成陽離子脂質體試劑的過氧化物。

7.對于穩(wěn)定轉染,篩選抗生素加入的太快:在加入篩選性抗生素前至少預留24-48h使細胞表達抗性基因。   

細胞轉染注意事項

1.如為貼壁生長細胞,一般要求在轉染前一日,必須應用胰酶處理成單細胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,轉染當日的細胞密度以70-90%(貼壁細胞)或2×106-4×106細胞/ml(懸浮細胞)為宜,最好在轉染前4h換一次新鮮培養(yǎng)液。

2.用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質,無RNA和其他化學物質的污染,OD260/280比值應在1.8以上。

3.有血清時的轉染:

1)在開始準備DNA和陽離子脂質體試劑稀釋液時要使用無血清的培養(yǎng)基,因為血清會影響復合物的形成。其實,只要在DNA-陽離子脂質體復合物形成時不含血清,在轉染過程中是可以使用血清的。

2)陽離子脂質體和DNA的最佳量在使用血清時會有所不同,因此在轉染培養(yǎng)基中加入血清時需要對條件進行優(yōu)化。

3)大部分細胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內保持健康。對于對血清缺乏比較敏感的細胞,可以使用OPTI-MEM培養(yǎng)基,一種營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基。

4.培養(yǎng)基中的抗生素

抗生素是影響轉染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導致轉染效率降低。所以,在轉染培養(yǎng)基中不能使用抗生素。

對于穩(wěn)定轉染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因為這些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素(穩(wěn)定轉染常用的抗性篩選試劑)的競爭性抑制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長,使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。

5.設置陽性對照和陰性對照。

6.一般在轉染24-48h,靶基因即在細胞內表達。根據不同的實驗目的,24-48h后即可進行靶基因表達的檢測實驗。

7.如若建立穩(wěn)定的細胞系,則可對靶細胞進行篩選,根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物,常用的真核表達基因載體的標志物有潮霉素和新霉素等。

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