質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作步驟

1.1 轉(zhuǎn)化細(xì)胞細(xì)胞鋪板：將細(xì)胞按70%的匯合度接種到96孔板。
 
1.2 轉(zhuǎn)染：16h后轉(zhuǎn)染螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和RNA，每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)復(fù)孔
 
(1)配制DNA和轉(zhuǎn)染試劑: 96孔板轉(zhuǎn)染質(zhì)粒時(shí)每孔比例為pLenti：Firefly：Renilla：轉(zhuǎn)染試劑=0.2μg：0.1μg：0.01μg：0.25μL
 
(2)稀釋好DNA及轉(zhuǎn)染試劑，常溫孵育5min
 
(3)將稀釋好的DNA分別和轉(zhuǎn)染試劑混勻，常溫孵育20min
 
(4)每孔棄去15μL培養(yǎng)基，將15μL DNA轉(zhuǎn)染混合液添加到每孔細(xì)胞樣品中
 
(5)轉(zhuǎn)染6h后，換新鮮*培養(yǎng)基
 
2 轉(zhuǎn)化細(xì)胞雙報(bào)告基因檢測
 
(1)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48h后，棄去培養(yǎng)基，用100μL 1XPBS洗1遍
 
(2)傾斜96孔板，吸干剩余的PBS
 
(3)去離子水將5XPLB稀釋成1XPLB，使用前放到常溫
 
(4)每孔加50μL稀釋好的1X PLB，搖床常溫條件下?lián)u15min，進(jìn)行裂解
 
(5)白色不透光的96孔酶標(biāo)板中每孔加步驟4的上清液10μL，加入100μL預(yù)先混好的LAR II，2s后測數(shù)據(jù)
 
(6)每孔添加100μL預(yù)先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2s后，測數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞