細(xì)胞生長曲線的繪制操作步驟

ATCC細(xì)胞實驗用品

材料：貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞

器材：24孔培養(yǎng)孔板、吸管、膠帽、離心管、培養(yǎng)皿、半對數(shù)坐標(biāo)紙、蓋玻片、細(xì)胞計數(shù)板、酒精棉球、酒精燈、離心機、倒置顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱

試劑：Hanks液、DMEM培養(yǎng)基(含10％小牛血清)、0. 25％胰蛋白酶消化液、吉姆薩染液

實驗步驟

(1)消化：用0．25％胰蛋白酶溶液消化處于對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，收集消化的細(xì)胞于10 ml離心管中。

(2)離心：500～1000r／min離心5min，棄上清。

(3)加入DMEM培養(yǎng)基(含10％小牛血清)，制備單細(xì)胞懸液。

(4)計數(shù)：吹打均勻后對細(xì)胞進行計數(shù)。

(5)按2×104～5×104個／ml的ATCC細(xì)胞密度接種在24孔培養(yǎng)孔板內(nèi)。

(6)每天用胰蛋白酶溶液對其中3孔細(xì)胞進行消化，鏡下計數(shù)。

(7)計算3孔培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的平均值(細(xì)胞數(shù)／ml)。

(8)連續(xù)7天按上述方法消化3孔細(xì)胞并進行計數(shù)，算平均值。

(9)以培養(yǎng)時間作為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上，將各點連成曲線，即可獲得細(xì)胞的生長曲線(圖5-1)。

結(jié)果分析

培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線在正常情況下通常呈s形，觀察曲線可發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)初期(1～2天)的細(xì)胞數(shù)約呈下降趨勢，這段時期即為細(xì)胞滯留期(潛伏期)。滯留期之后的3～5天，細(xì)胞數(shù)增加顯著，呈對數(shù)增長的趨勢，此時細(xì)胞進入了對數(shù)生長期。當(dāng)對數(shù)生長期細(xì)胞數(shù)達到高峰，細(xì)胞生長逐漸停止，細(xì)胞數(shù)量進入穩(wěn)定狀態(tài)，此時即為平臺期(平頂期)。

注意事項

在進行生長曲線的測定時，接種到培養(yǎng)板孔中的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)保持每孔一致。接種量應(yīng)適當(dāng)，不能過少或過多，過少將使細(xì)胞生長周期延長，過多將導(dǎo)致細(xì)胞在實驗未完成前即需傳代，這兩種情況下所得到的生長曲線均不能較準(zhǔn)確地反應(yīng)ATCC細(xì)胞的生長狀況。