由于腫瘤細胞使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。而siRNA轉染途徑也是一種常用的RNAi技術，那么本文在此介紹向培養(yǎng)細胞遞送siRNA的*化方法。以下的所有建議適用于siRNA，確切地說，同樣可用于遞送siRNA模擬物/抑制劑。

(1)進行實驗時要保持一致

條件優(yōu)化后，應注意確保操作中每一步的順序、時間和方式一致。 整個實驗中變動因素越少，實驗結果的可重復性及可靠性越高。

(2)轉染時選擇恰當?shù)捻樞?/p>

標準的轉染操作中，須在轉染前約24小時細胞鋪板。 反向轉染操作中，細胞鋪板和轉染可同時進行，操作上節(jié)省了一整天的時間。 Ambion公司的科學家發(fā)現(xiàn)，在的反向轉染操作中(例如使用RNAiMax)：某些細胞系轉染效率稍高;siRNA的濃度通常會有所降低(這可能會降低脫靶效應);更廣泛濃度范圍內(nèi)的細胞都可成功使用。

(3)選用*密度的健康細胞

細胞的匯合度應為40–80%，并且傳代次數(shù)較低(比如小于50次)，即細胞不可太老。 隨著時間的推移，相對于較早傳代的細胞，培養(yǎng)細胞的表型和生長特性通常會呈多樣變化，這也會體現(xiàn)在表達譜中。

在培養(yǎng)條件影響下(例如頻繁的溫度和pH值變化、過度培養(yǎng)時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)不足、繼代培養(yǎng)時細胞密度太低、胰蛋白酶連續(xù)處理、激烈吹打或離心時的剪切力以及支原體污染)，許多細胞的表達譜會發(fā)生改變。 每孔的細胞太少或太多，也會影響轉染效率。 根據(jù)轉染容器的表面積，嘗試不同的細胞密度，比如設置低、中、高密度的孔。

(4)選擇恰當?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件

使用*的組織培養(yǎng)操作方法。 siRNA遞送過程中，抗生素不是必需的，細胞吸收抗生素后可能會增加毒性。此外，一些siRNA轉染試劑要求在無血清或低血清的培養(yǎng)基中轉染，所以一定要注意的建議。選擇恰當?shù)募毎囵B(yǎng)基(例如某些細胞需要更多的葡萄糖或氨基酸)。

(5)選用高質(zhì)量siRNA，使用zui低有效濃度

siRNA中應不含從合成過程帶來的試劑(例如乙醇或鹽)。 長于30bp的雙鏈RNA污染物可通過激活非特異性的干擾素反應，產(chǎn)生細胞毒性，從而改變基因的表達。 Ambion公司標準純度的siRNA沒有此類污染物，非常適合細胞培養(yǎng)實驗。 在優(yōu)化遞送條件的實驗中，確定選用的方法和細胞類型所需siRNA的zui低有效濃度，過量使用siRNA會增加非特異性(脫靶)效應。

(6)使用siRNA陽性和陰性對照以及未處理的樣品來監(jiān)測每次實驗的siRNA遞送

每次實驗必須包含siRNA陰性和陽性對照，以便監(jiān)測siRNA的遞送效率(即比較siRNA陽性對照處理的和siRNA陰性對照處理的細胞靶標基因的表達水平)。 在多數(shù)經(jīng)驗證的siRNA調(diào)控和細胞體系中，可看到mRNA調(diào)控靶標抑制效率高于≥70%。 此外，應通過比較siRNA陰性對照和未處理的樣品中培養(yǎng)的細胞活性來監(jiān)測siRNA遞送過程的細胞毒性。

(7)優(yōu)化轉染試劑選擇和劑量

不同細胞系和細胞類型的轉染難度差別很大。 RNAiMax轉染試劑能夠有效地將小RNA遞送到各種細胞中，而且細胞毒性非常小。

對于難轉染的腫瘤細胞系(如懸浮細胞、血液細胞、原代細胞和神經(jīng)細胞)，某公司的科學家們建議在不同的濃度下至少嘗試2種不同的轉染試劑。轉染試劑劑量不足會影響siRNA遞送和基因沉默效果，過多則會有細胞毒性。根據(jù)不同的細胞類型，需要不同數(shù)量的轉染試劑。

如果轉染結果不成功(基因抑制和/或細胞活性差)，可考慮采用電轉化方法或病毒載體來遞送siRNA。

(8)優(yōu)化轉染試劑/siRNA復合物接觸時間：siRNA Complexes

轉染效率受轉染試劑/siRNA復合物的劑量影響。如果細胞毒性和靶基因抑制效率都很高，轉染8–24小時后，可利用正常培養(yǎng)基更換含有轉染試劑/siRNA復合物的培養(yǎng)基，從而降低細胞毒性并保持高的基因沉默效應。
YSRIBIO825    Lincomycin Hydrochloride     鹽酸林可霉素標準品    7179-49-9     200mg
YSRIBIO826    Lidocaine     利多卡因標準品    137-58-6     250mg
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YSRIBIO829    L-Fucose (AS)    L-巖藻糖標準品    2438-80-4     200mg
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腫瘤細胞