教您這樣操作ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)不會(huì)失利。
1.有的包被原可能不是蛋白，關(guān)于生物素和脂類(lèi)物質(zhì)或小分子物質(zhì)咱們要事前對(duì)其改造再加以包被，我把辦法簡(jiǎn)明的列出如下：
2.親和素生物素：先親和素先包被載體，參加生物素化的DNA，這種包被辦法均勻、結(jié)實(shí)，已擴(kuò)展應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。
3.小分子必需依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才干固定在固相載體上。包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這聯(lián)系到你做出的抗體可不能夠 被其辨認(rèn)，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時(shí)，師兄都嚴(yán)格正告我必定要在冰浴下緩慢消融就是這個(gè)道理。
4.脂類(lèi)物質(zhì)：可將其在有機(jī)溶劑中溶解后參加Elisa板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或涼風(fēng)吹干，待酒精蒸發(fā)后，讓脂質(zhì)天然干固在固相外表。
5.應(yīng)留心以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體外表的疏水基團(tuán)間 的作用，這種物理吸附長(zhǎng)短特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易 吸附到固相載體外表。包被液的挑選，一般挑選ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時(shí)由于實(shí)驗(yàn)的需求，包被原的特殊性也可能選用中性的緩沖溶液來(lái)包。 具體的實(shí)驗(yàn)還要有堅(jiān)固的理論外也要實(shí)踐，看一下可不能夠應(yīng)用到自己實(shí)驗(yàn)當(dāng)中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有 pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
6.但選用什么，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體來(lái)實(shí)踐。常用封suo劑有：0.05%-0.5%的BSA；10%的小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價(jià)廉，能夠高濃度使 用(5%－10%)；還有一些稀有用到的各種動(dòng)物血清(首要為了排除相似蛋白攪擾)和酪蛋白等等。封suo就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些曠地閑暇， 然后排擠ELISA試劑盒后的過(guò)程中攪擾物質(zhì)的再吸附。封suo：繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。
7.在洗板時(shí)會(huì)有必定誤差，人為因素很大(當(dāng)然有條件的用洗板機(jī)在外)，洗的不*或串了孔，對(duì)如斯敏捷的ELISA體系但是不小的影響。由于 聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，為到達(dá)別離游離的和結(jié)合的酶符號(hào)物的意圖，鏟除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干 擾物質(zhì)，在洗刷時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的攪擾物質(zhì)洗刷下來(lái)。洗刷板：能夠說(shuō)在ELISA操作中，洗刷是zui首要的紐帶技能。
8.加抗體標(biāo)本(和二抗)：留意該換槍頭時(shí)換槍頭。標(biāo)本稀釋一般可用pbs稀釋?zhuān)部捎梅忾]液去稀釋。如需加二抗，還要留意二抗的工作濃度，太低則上色淺。
9.顯色：顯色體系又許多，咱們一開(kāi)始做的時(shí)候，要挑選適合的顯色體系。留意顯色體系酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加 疊氮鈉。
10.每次做盡量要把陰陽(yáng)空三個(gè)對(duì)照做好，如呈現(xiàn)問(wèn)題也好分析。