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技術(shù)文章

結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)?操作流程描敘

閱讀:385          發(fā)布時(shí)間:2021-8-31

結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)操作流程描敘:

         1、將要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的版孔進(jìn)行設(shè)定好,標(biāo)準(zhǔn)品 5 個(gè)點(diǎn),每個(gè)點(diǎn)設(shè)定平行,需要用到 10 個(gè)孔,空白只需 1 個(gè)孔。剩下孔可以做為樣本孔

         2、 稀釋標(biāo)準(zhǔn),準(zhǔn)備好 5 個(gè) EP 管,然后在每個(gè) EP 管中加入 150 微升標(biāo)準(zhǔn)稀釋液,編上編碼,分別為 1,2,3,4,5,在 1 號(hào)管中加入 150 標(biāo)準(zhǔn)品,用槍頭反復(fù)吹打 10 次左右(注意控制幅度不要過(guò)大容易產(chǎn)生氣泡)如果有渦旋儀可以在渦旋儀上渦旋 5 秒左右,然后換槍頭,在 1 號(hào)管中取 150 微升加入到 2 號(hào)管,后面過(guò)程一次類(lèi)推。最后稀釋完,前面 4 個(gè)管中每管液體在 150 微升,5 號(hào)管為 300 微升。濃度是從大到小。

         3、 標(biāo)準(zhǔn)、樣本、空白加樣:標(biāo)準(zhǔn)是每個(gè)濃度點(diǎn) 2 個(gè)孔(做平行),每孔加入 50 微升,加樣過(guò)程中注意換槍頭,樣本孔中每孔加入 50 微升,加樣過(guò)程中注意換槍頭,空白孔加入 50 微升標(biāo)準(zhǔn)稀釋液或者樣本稀釋液。特別要說(shuō)明的是,標(biāo)準(zhǔn)加樣和樣本加樣盡量控制在 15 分鐘內(nèi)加完,如果時(shí)間拖的太長(zhǎng),會(huì)導(dǎo)致前面孔先反應(yīng)后面孔才開(kāi)始反應(yīng),這樣數(shù)值偏差過(guò)大。加完樣后蓋上封板膜,至 37 攝氏度孵育 30 分鐘.

        4、洗版,在孵育過(guò)程中可以將洗滌液配好,20 ml30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水或者去離子水定容到 600 ml 即可。每孔加入 250-300 微升的洗滌液(不要漫過(guò)版孔),(如果有震蕩儀的話,可以講板子放入震蕩儀上 5 秒左右,然后靜止三十秒,沒(méi)有請(qǐng)忽略次過(guò)程)將板子在桌子上晃動(dòng) 5 秒左右,然后靜置 30 秒,甩干,拍板。說(shuō)明:甩干過(guò)程盡量要快,1 秒內(nèi)就可以完成,不要慢慢傾斜倒掉液體,直接翻板甩掉液體即可。拍板過(guò)程需要在桌子上墊一層吸水紙或者濾紙,版孔朝下拍幾下,拍干區(qū)別主要看吸水紙和濾紙上沒(méi)有明顯的水漬為完成。

         5、每孔加入 50 微升的酶標(biāo)試劑,此處在空白孔中不需要加(空白孔為空),孵育 30 分鐘。

         6、  洗版同步驟 4

         7、顯色,先每孔中加入 50 微升的顯色 A 液,然后每孔中加入 50  微升顯色  B  液。避光 37 攝氏度顯色 15 分鐘

         8、終止,每孔加入 50 微升的終止液,注意,加完終止液必須在 15  分鐘內(nèi)讀數(shù),超過(guò)時(shí)間讀數(shù)無(wú)效。在規(guī)定時(shí)間內(nèi)讀數(shù)都是有效的。

         9、至此,整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

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