細胞瓊脂克隆斑形成實驗方法

1.取MDA-435-OL-Sec23a-GFP和MDA-435-OLLV3NC-GFP對數(shù)生長期的細胞制成單細胞懸液, 使用血細胞計數(shù)板計數(shù)后備用。

2.使用梯度稀釋法適當稀釋細胞懸液后, 向6孔板的每個孔內(nèi)分別加入含50 個細胞的2 mL細胞懸液, 細胞懸液使用含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)液配制。每種細胞均設(shè)置3個6孔板復(fù)孔。

3.12 h后鏡下可觀察到6孔板內(nèi)細胞已經(jīng)全部貼壁, 此時將皿中培養(yǎng)液換成瓊脂濃度為0.2%的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液, 置于37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

4.10 d后鏡下可觀察到6孔板內(nèi)出現(xiàn)集落生長的細胞克隆斑。此時棄去含瓊脂的培養(yǎng)液, 用PBS 輕輕潤洗2次, 然后6孔板內(nèi)每孔加入2 mL冰甲醇固定30 min, 固定結(jié)束后使用PBS輕輕潤洗2次, 然后使用結(jié)晶紫染色5 min, 再用PBS輕輕潤洗后室溫干燥。

5.干燥完成后將6孔板移至顯微鏡下觀察計數(shù)每個孔內(nèi)細胞克隆斑數(shù)量, 超過50個細胞的克隆斑即可計數(shù)。根據(jù)細胞克隆斑形成率=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%來計算細胞體外克隆率。