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455次人腸平滑肌細胞實驗原理:當待測細胞懸液中細胞均勻分布時,通過測定一定體積懸液中的細胞的數目,即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。
具體操作:
一.準備工作:
取一瓶人腸平滑肌細胞,待長成單層后以被使用.
二.細胞懸液制備:
用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后,加入培養(yǎng)液(或hanks液或PBS等平衡鹽溶液),吹打制成待測細胞懸液。
三.人腸平滑肌細胞計數:
1.取一套血球計數板,將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上.
2.制備計數用的細胞懸液:用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中,加入5滴臺盼藍染液(0.4%)或苯胺黑?;罴毎粫蝗旧?,加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。
3.將細胞懸液滴入計數板:將待測細胞懸液吹均勻,然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入,要保證蓋片下充滿懸液,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中。
4.統(tǒng)計四個大格的細胞數:將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察,并移動計數板,當看到鏡中出現計數方格后,數出四角的四個大鉻(每個大格含有16個中鉻)中沒有被染液染上色的細胞數目。
5.計算原細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度:
細胞懸液的細胞數/ml=(四個大格子細胞數/4)×2×104
說明:/4因為計數了4個大格的細胞數;×2因細胞懸液:染液=1:1稀釋;×104因為計數板中每一個大格的體積為:1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1mm3 而 1ml=1000mm3
四.細胞計數要點:
1.進行細胞計數時,要求懸液中細胞數目不低于104個/ml,如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中;
2.要求細胞懸液中的細胞分散良好,否則影響計數準確性。
3.取樣計數前,應充分混勻細胞懸液,尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻,以求計數準確;
4.數細胞的原則是只數完整的細胞,若細胞聚集成團時,只按照一個人腸平滑肌細胞計算。如果細胞壓在格線上時,則只計上線,不計下線,只計右線,不計左線。
5. 操作時,注意蓋片下不能有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中,否則要重新計數。
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