細胞培養(yǎng)相關問題

細胞凍存講究“慢凍”。動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5～10% 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO) 和90～95%原來細胞生長用的新鮮細胞培養(yǎng)基均勻混合。由于DMSO稀釋時會放出大量熱能，不可將DMSO直接加入細胞液中，在使用前先行配制完成。用于細胞凍存的大部份添加物和試劑要冷藏，常用液體細胞培養(yǎng)基用于凍存時，zui多可以凍融3次，如果次數過多會將使含有的蛋白質發(fā)生降解和沉淀，這將會影響培養(yǎng)基的性能。
體外培養(yǎng)的貼壁細胞大多具有生長接觸抑制的特性，即當一個細胞被其他細胞包圍的時候，它就會停止生長，及時傳代后，細胞的生長得以繼續(xù)。一般采用胰蛋白酶消化的方式進行傳代。胰蛋白酶溶液的消化能力與溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca2+,Mg2+離子和血清等因素有關，通常情況下胰蛋白酶在pH8.0、溫度37℃時作用能力zui強，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力，每次進行傳代消化前，先用不含鈣、鎂離子的緩沖液沖洗細胞培養(yǎng)瓶，去除殘留的含血清的培養(yǎng)液，能明顯提高消化液的消化能力。多數細胞傳代消化使用的消化液為PBS溶液中添加0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA，EDTA主要是用來螯合能夠抑制蛋白酶活性的游離的鎂離子和鈣離子，以保持胰蛋白酶的活性。
通常細胞消化的時間越短越好，但是不同的細胞，其貼壁性有一定的差異，對于易消化的細胞控制其消化程度，對于貼壁性較強的細胞，在消化時可將消化液事先在37℃條件下進行預熱，消化時盡量控制在37℃條件下進行，可加快消化的時間及降低對細胞的損傷。值得注意的是，胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。