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如何選擇細(xì)胞培養(yǎng)的冷凍保護(hù)劑?

閱讀:1742          發(fā)布時(shí)間:2017-7-7

轉(zhuǎn)化細(xì)胞冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護(hù)劑常常配制成一定的溶液。一般來講,只有紅細(xì)胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的水或簡(jiǎn)單的鹽溶液中,并以zui適的冷凍速率冷凍,可以獲得活的凍存物。
但對(duì)于大多數(shù)有核哺乳動(dòng)物細(xì)胞來說,在不加冷凍保護(hù)劑的情況下,無zui適冷凍速率可言,也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細(xì)胞懸浮在不加冷凍保護(hù)劑的平衡鹽溶液中,并以0.3~600℃/min 的冷凍速率降溫冷凍,98% 以上的細(xì)胞會(huì)死亡;而加入甘油冷凍保護(hù)劑進(jìn)行冷凍保存時(shí),98% 以上的細(xì)胞都可存活。
冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類。
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滲透性冷凍保護(hù)劑
滲透性冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi),一般是一些小分子物質(zhì),主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護(hù)機(jī)制是在轉(zhuǎn)化細(xì)胞冷凍懸液*凝固之前,滲透到細(xì)胞內(nèi),在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度,降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度,從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷,同時(shí),細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過分外滲,避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。
甘油和DMSO并不防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰,在使用該類冷凍保護(hù)劑時(shí),需要一定的時(shí)間進(jìn)行預(yù)冷,讓甘油或DMSO等成分滲透到細(xì)胞內(nèi),在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。
目前DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛,但要注意的是,DMSO在常溫下對(duì)細(xì)胞的毒性作用較大,而在4℃時(shí),其毒性作用大大減弱,且仍能以較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)。所以,凍存時(shí)DMSO平衡多在4℃下進(jìn)行,一般需要40~60分鐘。
02
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非滲透性冷凍保護(hù)劑
非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi),一般是些大分子物質(zhì),主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護(hù)機(jī)制的假說很多,其中有一種可能是,聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子結(jié)合,降低溶液中自由水的含量,使冰點(diǎn)降低,減少冰晶的形成;同時(shí),由于其分子量大,使溶液中電解質(zhì)濃度降低,從而減輕溶質(zhì)損傷。
結(jié)語
不同的冷凍保護(hù)劑有不同的優(yōu)、缺點(diǎn)。目前一般多采用聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護(hù)劑組成保護(hù)液。由于許多冷凍保護(hù)劑(如 DMSO)在低溫下能保護(hù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞,但在常溫下卻對(duì)細(xì)胞有害,故在細(xì)胞復(fù)溫后應(yīng)及時(shí)洗滌冷凍保護(hù)劑。

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