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對(duì)淋巴細(xì)胞系進(jìn)行體外刺激預(yù)孵育、或板內(nèi)同步刺激培養(yǎng)

閱讀:1015          發(fā)布時(shí)間:2017-3-2

1、將抗原和淋巴細(xì)胞系在體外混合,刺激并預(yù)孵育,是通用的方法。預(yù)孵育的淋巴細(xì)胞,在置入ELISPOT板之前應(yīng)使用復(fù)溫到37℃的培養(yǎng)液清洗細(xì)胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培養(yǎng)5~6小時(shí)。

2、對(duì)于高度特異性抗原,可以采用將淋巴細(xì)胞和抗原同時(shí)加入ELISPOT板孔中,37℃培養(yǎng)箱中,同步進(jìn)行刺激、培養(yǎng)、和細(xì)胞因子捕獲。淋巴細(xì)胞板內(nèi)同步刺激培養(yǎng)的時(shí)間通常為22~24小時(shí)。

3、ELISPOT試驗(yàn)檢測(cè)的是每一個(gè)分泌細(xì)胞系因子的活化細(xì)胞。在培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)程中,任何移動(dòng)、震動(dòng)(包括開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱門(mén))都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在培養(yǎng)板上的移動(dòng),從而得到不規(guī)則斑點(diǎn)或者斑點(diǎn)花紋,影響zui終結(jié)果。因此細(xì)胞在ELISPOT培養(yǎng)板孵育的過(guò)程中,應(yīng)注意保持培養(yǎng)板的靜置,不應(yīng)對(duì)其移動(dòng)。

4、在使用抗原刺激淋巴細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變黃,這種現(xiàn)象通常見(jiàn)于使用很強(qiáng)的多克隆抗原刺激淋巴細(xì)胞,某些多克隆抗原會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡或者死亡,大量淋巴細(xì)胞死亡后使培養(yǎng)液變黃。使用這些淋巴細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)ELISPOT試驗(yàn)通常得到很低的斑點(diǎn)(SPOT)形成。換用特異性抗原后可以避免該現(xiàn)象。

5、在ELISPOT結(jié)果中出現(xiàn)不規(guī)則的大塊斑點(diǎn),有的區(qū)域沒(méi)有斑點(diǎn)的原因,不規(guī)則斑點(diǎn)區(qū)域的出現(xiàn)一般是細(xì)胞分離不*所至,有時(shí)候采用多克隆抗原孵育的淋巴細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生成團(tuán)現(xiàn)象。請(qǐng)確認(rèn)加入到ELISPOT板中進(jìn)行孵育的是單細(xì)胞懸液。

6、使用開(kāi)口較大的吸頭,動(dòng)作輕柔,避免對(duì)細(xì)胞系的吹打,減少剪切力對(duì)淋巴細(xì)胞的傷害。

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