細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)檢查

(一)一般形態(tài)觀察

生長狀態(tài)良好的細(xì)胞在普通顯微鏡下觀察時可見，細(xì)胞透明度大，輪廓不清，只有用相差顯微鏡觀察，才能看清細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。細(xì)胞內(nèi)顆粒少、無空泡，胞膜清晰，培養(yǎng)上清液清澈透明，看不到懸浮細(xì)胞和碎片；細(xì)胞功能不良時，輪廓增強，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則，甚至失去原有特點。只有生長狀態(tài)良好的細(xì)胞才能用于實驗。

細(xì)胞生長過程中，CO2積累增多，由于培養(yǎng)液內(nèi)含有pH指示劑，因此其顏色變化可間接反映細(xì)胞的生長狀態(tài)。正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色；呈橙黃色時，細(xì)胞一般生長狀態(tài)較好；呈淡黃色，則可能是培養(yǎng)時間過長、營養(yǎng)不足、細(xì)胞死亡過多；呈紫紅色，則可能是細(xì)胞生長狀態(tài)不好，或已死亡。

（二）細(xì)胞增殖生長狀態(tài)

初代或傳代培養(yǎng)時，都有一長短不同的潛伏期。傳代細(xì)胞系、胚胎組織或幼體組織潛伏期短，一般在第二天即可見細(xì)胞生長，一周內(nèi)便可連接成片。成體組織的潛伏期長，老齡組織和癌組織更長，有時可達一周左右。

初代組織塊培養(yǎng)法細(xì)胞生長，zui先從組織“長”出的為游走細(xì)胞，它們多單獨活動，形態(tài)不規(guī)則，用縮時逐格顯微攝電影法可顯示出極活躍的變形、游走和吞噬活動。在游走細(xì)胞之后，接著長出的是成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞。只有當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞分裂、細(xì)胞數(shù)量逐漸增多、形成較大生長暈或連接成片時，細(xì)胞才真正進入增殖狀態(tài)。成纖維細(xì)胞是zui易生長細(xì)胞，生長速度較快，低倍鏡下觀察時，前哨部位細(xì)胞似火焰狀或放射形狀向外擴展；如接種為游走細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞，在密度不大時，可連接成網(wǎng)狀，只有細(xì)胞密度增大時才連接成片。

上皮細(xì)胞排列緊密，相互接壤成膜狀；上皮膜邊緣整齊，細(xì)胞很少單獨活動，生長時整個上皮膜發(fā)生移動。上皮細(xì)胞尤其是外胚層來源的細(xì)胞如表皮細(xì)胞等，生長過程中常產(chǎn)生溶解酶，能使細(xì)胞間質(zhì)發(fā)生液化，導(dǎo)致細(xì)胞相互分離，嚴(yán)重時可導(dǎo)致細(xì)胞脫落，其確切機制尚不明了．可能與產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶有關(guān)。

細(xì)胞接種后，經(jīng)過懸浮期、潛伏期和指數(shù)增生期等后，zui終將長滿瓶壁，如不及時做再培養(yǎng)，由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物積累，細(xì)胞即進入停滯期。此時細(xì)胞輪廓增強，細(xì)胞內(nèi)常出現(xiàn)前述有膨脹線粒體形成的堆積物，細(xì)胞變得粗糙，嚴(yán)重時細(xì)胞從瓶壁脫落，只有及時做傳代，才能使細(xì)胞繼續(xù)生長。

(三)微生物污染

在長時間反復(fù)培養(yǎng)過程中，即使細(xì)胞培養(yǎng)用品消毒操作嚴(yán)密，也會偶爾發(fā)生細(xì)菌、支原體、真菌、病毒和其他雜質(zhì)細(xì)胞污染，需隨時注意，一旦發(fā)生污染，應(yīng)及時進行處理。

(四)培養(yǎng)液

在正常情況下，培養(yǎng)液pH介于7．2～7．4，呈紅色。用一般培養(yǎng)箱培養(yǎng)時，隨細(xì)胞生長時間延長，CO2積累增多，在超過緩沖范圍之后，營養(yǎng)液酸化逐漸變黃色，這時如不
及時調(diào)節(jié)pH，會對細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時可使細(xì)胞退變死亡。培養(yǎng)液中加N-(2-羥乙基)N’-2-乙烷磺酸（N-2 Hydroxyethylpiperazme-N’-2-ethanesulionicacid，HEPES)或用5％CO2溫箱培養(yǎng)可使pH維持穩(wěn)定。用含磷酸鹽緩沖系統(tǒng)培養(yǎng)液時，可因瓶口漏氣，CO2溢出，也可能由于培養(yǎng)瓶塞洗刷不潔，殘留堿性物質(zhì)所致，使之變?yōu)閴A性而呈紅色。更換營養(yǎng)液的時間，可依據(jù)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗而定，細(xì)胞生長旺盛時，2～3d更換一次；生長緩慢時，3～4d更換為宜。需特別注意，各種細(xì)胞對pH的要求不同。