研究了很久的原代細(xì)胞培養(yǎng)，如何能夠使細(xì)胞形態(tài)更好、養(yǎng)的更漂亮，在此把一些經(jīng)驗(yàn)和體會(huì)總結(jié)分享給大家！
不同的細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求不一樣
這個(gè)不僅僅是說培養(yǎng)基的不同，還有就是細(xì)胞生長(zhǎng)的空間密度問題。有一些細(xì)胞是數(shù)量多一點(diǎn)比較好生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)也比較好。這種一般是屬于生長(zhǎng)速度慢的細(xì)胞。譬如內(nèi)皮細(xì)胞。而有一些是細(xì)胞是數(shù)量少一點(diǎn)細(xì)胞狀態(tài)會(huì)生長(zhǎng)的比較好，譬如巨噬細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞。
尤其是巨噬細(xì)胞，生長(zhǎng)速度非常得快，貼壁速度很快，所以傳代時(shí)就應(yīng)該留很少量的細(xì)胞，這樣細(xì)胞狀態(tài)會(huì)比較好。并且巨噬細(xì)胞比較喜歡扎堆生長(zhǎng)，而堆與堆之間是有空間的。如果長(zhǎng)成相連在一起的一滿片的時(shí)候，細(xì)胞形態(tài)基本上就會(huì)差了，老化的會(huì)比較多，對(duì)后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不好的。
所以在養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候應(yīng)該摸索該細(xì)胞喜歡的生長(zhǎng)空間密度。
養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)怎么都不好？
對(duì)于貼壁細(xì)胞，如果細(xì)胞形態(tài)不好，或者細(xì)胞形態(tài)不清晰，表面似有異物等，可以在傳代的時(shí)候進(jìn)行如下操作：
      首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，加入 3 mL 新的培養(yǎng)基（有無血清的都可）洗滌一次，用滴管吸走。然后再加入 3 mL 的培養(yǎng)基，進(jìn)行預(yù)吹打，控制吹打力度，輕輕地大概沿著瓶底過一遍，然后吸走。這時(shí)侯再開始正式的消化、吹打。
注：巨噬細(xì)胞我們只吹打，不消化的。
其次，把吹打下來的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)瓶事先加入培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞貼壁情況。10 分鐘觀察一次，20 分鐘，30 分鐘觀察一次。選擇一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，已經(jīng)有部分細(xì)胞貼壁的情況下，重新置于潔凈臺(tái)，底面朝上迅速倒出其中的培養(yǎng)基，加入 3 mL 新培養(yǎng)基再輕輕洗一次。然后加入*培養(yǎng)基培養(yǎng)。后續(xù)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況以及形態(tài)。這就是二傳。
如果一次效果還不理想，可重復(fù)多次。直到找到細(xì)胞形態(tài)。其中要注意結(jié)合細(xì)胞喜歡的生長(zhǎng)情況。喜歡多一點(diǎn)數(shù)量長(zhǎng)得好的細(xì)胞你就等貼壁細(xì)胞比較多點(diǎn)的時(shí)候再傳。反之亦然。這個(gè)方法真的很好用。
培養(yǎng)基的量的問題
這個(gè)是要靠自己去摸索你所養(yǎng)的細(xì)胞的。并不是小的玻璃方瓶 12 mL，大方瓶14mL 的。有些細(xì)胞反而是培養(yǎng)基少一點(diǎn)相反細(xì)胞形態(tài)會(huì)長(zhǎng)得比較好。對(duì)于生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞，易生長(zhǎng)的細(xì)胞加少一點(diǎn)培養(yǎng)基細(xì)胞形態(tài)會(huì)更好。但是要注意換液掌握。
培養(yǎng)瓶選擇的問題
個(gè)人發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞在玻璃瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的狀態(tài)會(huì)比一次性塑料瓶相對(duì)好一些。而對(duì)于同一種細(xì)胞，在其生長(zhǎng)旺盛快速的時(shí)期在玻璃瓶?jī)?nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)也比塑料瓶?jī)?nèi)好。這可能是因?yàn)樗芰掀勘炔Ａ扛菀踪N壁。生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞在塑料瓶這種相對(duì)更安逸的環(huán)境里反而長(zhǎng)得狀態(tài)不如玻璃瓶好。
所以對(duì)于生長(zhǎng)速度慢的細(xì)胞如果想要更漂亮的細(xì)胞狀態(tài)，塑料瓶比玻璃瓶會(huì)好，對(duì)于生長(zhǎng)速度慢的細(xì)胞，玻璃瓶則會(huì)更好。同樣，對(duì)于同一種細(xì)胞，在其生長(zhǎng)速度慢的時(shí)候，塑料瓶會(huì)好一點(diǎn)，比如剛剛復(fù)蘇的時(shí)候，或者原代培養(yǎng)的時(shí)候。而在其生長(zhǎng)旺盛的時(shí)候，玻璃瓶則相對(duì)會(huì)好一點(diǎn)。
傳代時(shí)消化的問題
      可以這樣說，對(duì)于需要消化傳代的細(xì)胞，每一次的消化都是對(duì)這個(gè)細(xì)胞存活與否，狀態(tài)好與不好zui至關(guān)重要的考驗(yàn)。
很多同學(xué)都遇到過這個(gè)問題，自己養(yǎng)的細(xì)胞開始的幾代長(zhǎng)的還挺好的，可是穿過幾代之后就發(fā)現(xiàn)自己的細(xì)胞不行了，狀態(tài)越來越差勁了。對(duì)于這個(gè)問題，可以非?？隙ǖ卣f，你的消化環(huán)節(jié)出問題了。你每一次的消化都讓細(xì)胞受到較大損傷了。所以，越長(zhǎng)越差。
      在消化的過程中，你加入胰酶后，所有細(xì)胞都在被胰酶消化著，但是我們忽視了一個(gè)問題就是，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)是不一樣的，每一個(gè)原代細(xì)胞的貼壁情況也是不一樣的，有的貼壁牢固，有的貼壁沒有那么牢固的，所以，讓所有的細(xì)胞消化同樣的時(shí)間對(duì)細(xì)胞是不公平的，他們受到了差別待遇當(dāng)然會(huì)有脾氣啊。我后來對(duì)消化的方法進(jìn)行了改良，我稱之為四步消化法，以難消化細(xì)胞為例，具體操作如下：
1.首先不加胰酶，倒掉舊培養(yǎng)基加入少量新培養(yǎng)基洗 1-2 遍。這是前奏，即為*步，目的是將漂浮著的死細(xì)胞之類盡量洗掉。
2.然后再加入少量新培養(yǎng)基直接吹打一遍，這一遍是把貼壁不牢固的細(xì)胞吹打下來。再用培養(yǎng)基洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶，即為第二步。你可以將這些傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面胰酶消化過的細(xì)胞對(duì)比觀察看誰長(zhǎng)的更好一點(diǎn)就知道該細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感度了。
3.吸干凈瓶?jī)?nèi)剩余液體，加入 0.3 mL 左右的胰酶潤(rùn)洗一遍，吸掉棄之，再加入 1 mL 左右的胰酶消化。消化的同時(shí)置于顯微鏡下觀察，待細(xì)胞與細(xì)胞之間間隙明顯的時(shí)候立即吸掉胰酶與干凈子彈頭里備用，加入新培養(yǎng)基開始吹打，吹打 2-3 遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存。用 2 mL 左右新培養(yǎng)基洗一遍與前面的混合。你也可以傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面及前面的做對(duì)比。這是第三步。
4.然后把前面剛吸出來的胰酶重新加進(jìn)去瓶里繼續(xù)消化剩余的貼壁牢固的細(xì)胞。當(dāng)然你也可以用新的胰酶，如果你們那比較富裕的話。繼續(xù)鏡下觀察，待剩余細(xì)胞間隙明顯，細(xì)胞獨(dú)立開來的時(shí)候，吸掉胰酶，加入新培養(yǎng)基吹打。懸液傳入新瓶培養(yǎng)，以實(shí)際情況你自己把握。
其實(shí)還可以有第五步，對(duì)于特別難消化的細(xì)胞和對(duì)胰酶特別敏感的細(xì)胞的話，你可以繼續(xù)加第五步甚至第六步。為了細(xì)胞更好的狀態(tài)，更漂亮的樣子，沒辦法，你必須分多批多次消化，這樣才能zui大限度地將胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷降到zui低，保證細(xì)胞的狀態(tài)能夠*。
當(dāng)然了，如果細(xì)胞是屬于那種很容易消化的細(xì)胞，像 RAW264.7，僅僅第二步就搞定了。就沒必要第三步第四步了。這個(gè)是需要你在實(shí)驗(yàn)中能夠自己用心去體會(huì)的。建議你接手一個(gè)新細(xì)胞時(shí)把各步消化的細(xì)胞分別培養(yǎng)起來做比較，去摸索好細(xì)胞對(duì)胰酶的要求，便于你后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。
將細(xì)胞消化分成這幾步，除了是為了避免胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷之外，還有一個(gè)更重要的作用就是，可以zui大程度地把細(xì)胞吹打成單個(gè)單個(gè)的狀態(tài)，不成片不連體。
因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)的時(shí)候肯定是要相互，大部分的細(xì)胞都是要成片生長(zhǎng)的，尤其是對(duì)于貼壁細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞貼壁之后長(zhǎng)著長(zhǎng)著就長(zhǎng)到一片去了。但是如果是成片的細(xì)胞抱團(tuán)的話，傳代后細(xì)胞是不能貼壁的，這樣抱團(tuán)的細(xì)胞就會(huì)死亡。所以，消化傳代的時(shí)候一定要將細(xì)胞消化成單個(gè)單個(gè)的獨(dú)立狀態(tài)，這個(gè)是非常考究你的功夫的。
細(xì)胞一旦脫落入懸液里你很難再將他吹打成單個(gè)，因?yàn)樗麤]有受力點(diǎn)了。很難找到受力點(diǎn)讓你對(duì)他吹打的力分散開細(xì)胞。所以必須要在細(xì)胞未脫落之前將其吹打開，受力點(diǎn)就是細(xì)胞貼壁的地方。這樣你就必須要嚴(yán)格控制好消化的程度，這和大師做飯掌握好火候是一樣的道理。
既要消化到容易吹打下來，又不能太過，一吹就整片脫落，要單個(gè)單個(gè)地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長(zhǎng)狀態(tài)貼壁程度的細(xì)胞能夠都維持在好的受力點(diǎn)分散開。這個(gè)是很重要的一點(diǎn)。尤其是對(duì)于某些細(xì)胞這一點(diǎn)就是他活或死的致命點(diǎn)，像 Caco-2 細(xì)胞就是如此。
另外關(guān)于傳代很重要一點(diǎn)就是一定不能等到細(xì)胞長(zhǎng)滿的時(shí)候才去消化傳代。要在細(xì)胞長(zhǎng)到 70% 左右的時(shí)候就要傳代了，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)中已經(jīng)有疊層生長(zhǎng)的時(shí)候就要立即進(jìn)行消化傳代，不能再拖。
換液傳代時(shí)候洗瓶的問題
對(duì)于用 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，你在洗的時(shí)候如果是用無血清 1640 去洗細(xì)胞在隨即后的幾次中會(huì)比用 DMEM 洗的長(zhǎng)的要好。同樣，用 1640 培養(yǎng)的也有這個(gè)現(xiàn)象。
如果不嫌麻煩的話，可以用 PBS 來洗，洗的效果和用無血清培養(yǎng)基洗的效果基本上是一樣的，對(duì)于有些細(xì)胞會(huì)更勝*。洗的目的主要是洗去培養(yǎng)瓶里殘留的血清，防止它對(duì)胰酶的影響。這樣能夠保證胰酶的消化能力優(yōu)先，是很關(guān)鍵的一點(diǎn)。
使用 PBS 洗是很重要的一步，zui近發(fā)現(xiàn)，用 PBS 就可以把細(xì)胞消化開來。加入 PBS 放置 10 ~ 15 分鐘，有些需要更長(zhǎng)的時(shí)間，等到細(xì)胞一個(gè)個(gè)分離開來的時(shí)候，就可以直接吹打下來，但是和胰酶消化一樣，要控制好時(shí)間，不能時(shí)間太過了，要不然損傷細(xì)胞，細(xì)胞不容易成活，狀態(tài)容易不好。這個(gè)方法對(duì)于某些細(xì)胞是很管用的。有些原代細(xì)胞用胰酶消化不容易消化成單個(gè)的時(shí)候，或者臨時(shí)沒有胰酶了，可以選用此方法。不過一定要試試，看是否適合你的細(xì)胞。