細(xì)胞株污染是世界細(xì)胞庫面臨且長(zhǎng)期存在的一大問題。每年都會(huì)由于細(xì)胞污染導(dǎo)致數(shù)萬美元的損失。

而在這些污染之中, 支原體污染是首要威脅。支原體是廣泛存在于自然界中能獨(dú)立生活的zui小微生物, 直徑300~800 nm, 能在細(xì)胞內(nèi)繁殖, 且細(xì)胞壁的缺乏使其對(duì)常見抗生素如青霉素和鏈霉素具有更高的耐受性, 其靈活、小規(guī)模和多態(tài)性使它更容易透過0.22~0.45 μm濾膜。自1956年Robinson等*次報(bào)道支原體污染以來, 世界各地實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫開始重視并檢測(cè)細(xì)胞中是否存在支原體污染。有文獻(xiàn)指出, 細(xì)胞培養(yǎng)過程中, 支原體感染發(fā)生率高達(dá)30%~60%。因此, 及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)出所培養(yǎng)的細(xì)胞是否有支原體污染至關(guān)重要。污染細(xì)胞的支原體主要有人源、豬源和牛源三類, 大部分是發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentants)、豬鼻支原體(M. hyorhinis)、口腔支原體(M. orale)、精氨酸支原體(M. arginini)、梨支原體(M. pirum)、唾液支原體(M. salivarium)、萊氏無膽甾支原體(Acholeplasmalaidlawii)和人型支原體(M. hominis)。

支原體污染會(huì)影響細(xì)胞的形態(tài)、功能、代謝、細(xì)胞膜、生長(zhǎng)速率、誘導(dǎo)染色體畸變、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等各種細(xì)胞特性。受支原體污染的細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基的pH值不會(huì)發(fā)生改變, 也不會(huì)渾濁,因此, 很難直接觀察出細(xì)胞是否受到污染。常用的支原體檢測(cè)方法有培養(yǎng)法、DNA熒光染色法、酶聯(lián)免疫吸附法和PCR法等。

1. 培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是zui傳統(tǒng)的檢測(cè)方法, 該方法能直觀地顯示是否存在支原體污染。將細(xì)胞培養(yǎng)物置于PPLO肉 湯 培 養(yǎng) 基(pleuropneumo-nia-like organismsbroth base)中, 37 °C培養(yǎng)3天后離心, 將沉淀物轉(zhuǎn)移至PPLO瓊脂培養(yǎng)基相同條件下培養(yǎng)4~6周, 觀察是否有“煎雞蛋”樣菌落出現(xiàn), 若有即為支原體污染。

這種方法簡(jiǎn)單易行, 但耗時(shí)比較長(zhǎng), 且存在不少缺陷。支原體由于遺傳缺陷, 導(dǎo)致某些代謝途徑缺失, 其生長(zhǎng)很大程度依賴于培養(yǎng)基的成分。在
配制培養(yǎng)基時(shí), 任何成分質(zhì)量或批次的不同都會(huì)影響支原體的生長(zhǎng), 從而影響檢測(cè)的靈敏度。不同的生長(zhǎng)條件(如好氧、厭氧、微氧等)也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果, 易導(dǎo)致假陽性。此外, 還有許多支原體無法培養(yǎng), 因此, 使用培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果并不全面。

2. DNA熒光染色法

DNA熒光染色法是基于使用熒光染料DAPI或Hoechst 33258的細(xì)胞化學(xué)染色法。熒光染料能選擇性的結(jié)合細(xì)胞和支原體DNA的小溝, 因此, 細(xì)胞株在準(zhǔn)備過程中, 任何存在的DNA均會(huì)被染色且DNADAPI復(fù)合物吸收波長(zhǎng)為340~488nm。將待測(cè)細(xì)胞單層培養(yǎng)至70%~90%匯合度時(shí), 用細(xì)胞刮刀收取, 以5×104/mL~1×105/mL濃度轉(zhuǎn)接至蓋玻片上培養(yǎng)12~24小時(shí), 用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌, 并在37 °C下用DAPI-甲醇溶液染色15分鐘, 無菌水洗滌
并烘干后置于檸檬酸緩沖液(pH5.5)?甘油(2?1)條件中, 用指甲油密封。處理后的玻片置于熒光顯微鏡下觀察, 被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后, 細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光點(diǎn)。
常溫，避光    UV法含量測(cè)定    *：    萘普生    規(guī)格:    100mg
常溫，避光    含量測(cè)定    *：    潑尼松    規(guī)格:    100mg
常溫，避光    含量測(cè)定    *：    青蒿琥酯    規(guī)格:    50mg
常溫，避光    含量測(cè)定    *：    氫溴酸右美沙芬    規(guī)格:    100mg
常溫，避光    UV法含量測(cè)定    *：    舒必利    規(guī)格:    100mg
常溫，避光    含量測(cè)定    *：    沙丁胺醇    規(guī)格:    100mg
細(xì)胞株