ELISA實驗做不好？我們?yōu)槟鷧R總了常見的30個問題?。ǘ?/h2>

閱讀：3505      發(fā)布時間：2020-3-23

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上一期我們?yōu)榇蠹覅R總了ELISA實驗原理、樣本準(zhǔn)備和預(yù)實驗相關(guān)的十個常見問題及解答，可能有心急的小伙伴早就想要了解更多后續(xù)關(guān)于ELISA實驗方面的問題了，不要走開，接下來將給您帶來相關(guān)解答~
 

Q：in vivo實驗周期長，不太好做預(yù)實驗，對ELISA結(jié)果會有影響么？怎么辦？

A：如果您實驗室之前建立的in vivo實驗protocol經(jīng)過驗證，可以保證有效性，那么，可以不用再進(jìn)行相關(guān)的預(yù)實驗；并且，如果實驗周期較長，樣本獲取不易，同時又需要檢測較多指標(biāo)，建議將樣品分裝凍存，避免反復(fù)凍融。ELISA實驗還是建議進(jìn)行一下預(yù)實驗，摸清楚樣本的佳稀釋比例，取得更好的實驗結(jié)果。

 

Q：檢測樣本是細(xì)胞培養(yǎng)上清，那么細(xì)胞數(shù)目對炎癥因子的濃度有影響嗎？

A：有影響，所以不同樣本可以比較的前提條件是培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)水平接近一致。因不同處理，可能會導(dǎo)致細(xì)胞生產(chǎn)狀態(tài)不同，要保證在鋪板時接種細(xì)胞數(shù)量水平一致。

 

Q：打開試劑盒，發(fā)現(xiàn)wash buffer析出結(jié)晶，對實驗結(jié)果有影響么？怎么辦？

A：wash buffer為高濃度鹽溶液，在低溫保存條件下，有可能出現(xiàn)結(jié)晶析出，為正常現(xiàn)象，可以放在37℃或55℃烘箱中，析出的結(jié)晶會溶解，溶解后可正常使用。不可以在結(jié)晶存在的情況下配置wash buffer。
 

Q：愛必信的ELISA試劑盒顯色液是雙組份的，有些其他品牌的是單組分的，使用單組分的有影響么？

A：HRP酶標(biāo)二抗的ELISA試劑盒，顯色底物一般為TMB，TMB不穩(wěn)定，曝光或污染氧化后會出現(xiàn)顯色反應(yīng)，導(dǎo)致實驗背景升高，或無法使用，所以愛必信的ELISA試劑盒將顯色液調(diào)整為雙組份，方便穩(wěn)定保存，僅在使用前混合，避免了TMB的不穩(wěn)定影響實驗結(jié)果。如您選用的試劑盒為單組分顯色液，在使用前檢測是否為無色透明，如果是正常的，對結(jié)果也沒有影響，可以放心使用。
 

Q：同一樣品多次ELISA檢測，測試結(jié)果差異大怎么解決？

A：應(yīng)考慮的問題包括：

• 樣本保存不當(dāng)，會導(dǎo)致多次實驗結(jié)果偏差較大，樣本應(yīng)盡量減少反復(fù)凍融，如需多次檢測，需在取樣后分裝保存；
• 樣品凍融之后未混勻，應(yīng)混勻后再上樣；
• 加樣不準(zhǔn)確，微量樣品加樣時要注意移液器槍頭不要有殘留。

 

Q：副孔差別比較大，是沒洗干凈嗎？

A：復(fù)孔值差異較大，主要原因應(yīng)考慮加樣是否準(zhǔn)確，洗板過程中是否有殘留以及是否有交叉污染。加樣應(yīng)注意移液器量程，以及槍頭殘留問題；洗板過程應(yīng)注意不要有殘留液體，需要進(jìn)行拍干操作；孵育過程要更換封板膜，拍干過程要換吸水紙，避免交叉污染。
 

Q：加完終止液之后測的幾次數(shù)據(jù)差別也蠻大，是什么原因？

A：加完終止液后，顯色反應(yīng)也不是永遠(yuǎn)停止，形成的黃色顏色會隨著時間延長繼續(xù)加深，建議在15 min內(nèi)讀數(shù)。
 

Q：整個過程需要避光嗎？避光需要避到什么程度呢？

A：ELISA實驗中，在酶標(biāo)抗體孵育，以及顯色底物孵育這兩步建議避光，其他步驟無需避光。避光可采用錫紙包裹，或?qū)⒄麄€ELISA板子放入暗盒或抽屜等無光處即可。
 

Q：封板膜什么時候用？每次加液后都要換嗎？

A：封板膜在孵育樣品、檢測抗體以及HRP酶標(biāo)抗體時，都要蓋好封板膜，減少揮發(fā)及污染幾率。每次使用后要更換新的封板膜。
 

Q：ELISA實驗中的洗板步驟如果沒有洗板機，需要如何操作？

A：實驗室ELISA實驗做的較多，還是建議使用洗板機洗板，效果更好，也更方便控制。如果沒有洗板機，在洗板過程中，需要注意洗板液添加后不要從孔中溢出，在加洗板液后，靜置1-2min，甩干液體后，在吸水紙上大力拍干；重復(fù)三次。
 

Q：手動洗板過程中，拍過抗體或抗原的濾紙需要扔嗎？

A：是需要更換的，防止造成交叉污染，影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。
 

今天的FAQ就到這里啦，小編在這里做個總結(jié)，實驗過程中重要的就是上樣、孵育和洗板，上樣要注意樣本混勻、加樣準(zhǔn)確，孵育要蓋好封板膜，避免交叉污染，洗滌則要避免液體殘留，建議洗板機洗板，并且要拍干。注意這些細(xì)節(jié)問題，相信各位同學(xué)肯定可以得到好的ELISA實驗結(jié)果，下期我們再給您帶來ELISA數(shù)據(jù)獲取及處理方面的一些問題，感興趣的小伙伴們繼續(xù)關(guān)注吧~

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