多發(fā)性硬化癥(MS)是一種慢性免疫調節(jié)疾病，主要影響中樞神經系統(tǒng)(CNS)，導致世界各地年輕人的神經殘疾。近年來，多發(fā)性硬化癥治療技術的進步和治療疾病藥物的增加為預防與該病相關的殘疾癥狀的復發(fā)提供了樂觀的前景。抑郁癥是多發(fā)性硬化癥患者的常見癥狀，在發(fā)病前后與運動癥狀同時出現。目前治療MS的方法并不能有效地同時解決身體殘疾和抑郁癥。羅氟司特是一種具有抗炎特性的磷酸二酯酶-4(PDE-4)抑制劑，已顯示出治療自身免疫性疾病的前景。

2024年4月1日，東南大學醫(yī)學院神經精神病學研究所附屬中大醫(yī)院神經內科張志珺教授團隊在Journal of Affective Disorders上發(fā)表題為“Roflumilast: Modulating neuroinflammation and improving motor functionand depressive symptoms in multiple sclerosis"的研究論文，該研究表明羅氟司特可能成為改善MS抑郁癥狀和急性時相運動障礙的潛在藥物，其抗炎、減炎和抑制小膠質細胞激活的特性提示其在MS治療中的潛力。IL6、IL1B和TNF是MS和抑郁癥共有的關鍵基因，其編碼的細胞因子存在蛋白質相互作用。IL-6可能在多發(fā)性硬化癥相關抑郁中發(fā)揮重要作用，IL-6拮抗劑可能成為改善多發(fā)性硬化癥抑郁的潛在治療策略。研究結果為進一步闡明MS和抑郁癥的發(fā)病機制提供了重要線索。

接下來，小愛具體介紹該研究團隊的實驗方法和主要研究結果。

一、實驗方法

研究人員采用實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠模型，研究羅氟司特的作用。評估運動功能障礙和抑郁癥狀，并進行組織病理學分析，評估其抗炎特性。流式細胞術檢測藥物對大腦小膠質細胞的影響。用雙抗體夾心法檢測大鼠海馬區(qū)TNF-α，IL-1β和IL-6水平。

下面小愛主要介紹大鼠EAE模型的誘導方法

1、實驗動物

11周齡雌性SD大鼠（上海實驗動物中心提供），這些大鼠生活在受控的環(huán)境條件下（包括12h的明暗循環(huán)和20-22℃的室溫）。

2、EAE誘導

將等量新鮮勻漿的豚鼠脊髓與含10mg/mL卡介苗(BCG)的CFA用注射器在冰水混合物中大力混合，制成油包水乳劑。將上述乳劑按400μL總體積皮下注射于大鼠腿墊內。陰性對照組注射等體積的0.9%氯化鈉溶液與CFA混合的乳劑。分別于免疫后0h和48h腹腔注射0.1mL百日咳疫苗懸液（Absin，abs42024900）。

3、EAE癥狀評估

研究人員評估了從EAE誘導開始到安樂si為止的運動功能相關神經行為缺陷。評分等級如下：

0級，無明顯運動障礙；1級，尾部癱瘓；2級，后腿癱瘓；3級，后腿癱瘓；4級，四肢癱瘓；5級，垂死或死亡。

二、研究結果

1、羅氟司特減輕EAE大鼠運動功能障礙和抑郁癥狀

研究人員分別從EAE誘導當天開始注射0mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg和2mg/kg的羅氟司特（標記為試驗組Vehicle, Roflumilast(0.5)，Roflumilast(1)，和Roflumilast(2)組），直至動物安樂si(圖1A)。在EAE誘導第10天的大鼠中觀察到了疾病的連續(xù)發(fā)病。為了評估羅氟司特作為多發(fā)性硬化癥抑郁癥狀藥物治療的潛力，研究人員在運動功能障礙癥狀出現前對EAE大鼠進行了蔗糖偏好試驗(SPT)和強迫游泳試驗(FST)。結果表明，與陰性組相比，Vehicle組在蔗糖偏好方面有顯著下降；Roflumilast(2)組與Vehicle組相比，顯著升高(圖1B)。FST結果顯示，與陰性組相比，Vehicle組的不動時間顯著增加(圖1C)。然而，羅氟司特(2)組與Vehicle組相比，顯著縮短了不動時間。此外，Roflumilast(1)、Roflumilast(2)組平均每日神經行為缺陷評分和累積神經功能缺陷評分均明顯低于Vehicle組(圖1D和E)。

圖1 羅氟司特減輕EAE大鼠運動功能障礙和抑郁癥狀

2、羅氟司特減輕EAE大鼠脊髓組織病理學損傷

研究人員在術后第22天取大鼠脊髓組織石蠟切片，進行組織病理學分析。陰性組脊髓組織內未見明顯的炎性細胞群，Vehicle組在脊髓實質內表現出大量炎癥細胞簇。對HE染色切片進行半定量分析，結果顯示Vehicle組的組織病理學評分高于陰性組；Roflumilast(2)組的得分顯著低于Vehicle組(圖2A和B)。LFB和甘氨酸銀染色的組織學切片分析顯示了相同的病理變化。LFB染色分析顯示，與Vehicle組相比，Roflumilast(2)組脊髓組織白質區(qū)脫髓鞘百分比顯著降低(圖2A和C)。此外，甘氨酸銀染結果顯示，與Vehicle組相比，Roflumilast(2)組脊髓組織白質區(qū)軸突密度有統(tǒng)計學意義的增加(圖2A和D)。

圖2 羅氟司特減輕EAE大鼠脊髓組織病理學損傷

3、羅氟司特抑制EAE大鼠脊髓小膠質細胞的炎性增殖

Iba1和GFAP通常分別用作小膠質細胞和星形膠質細胞的標記。研究人員對脊髓石蠟切片免疫組織化學染色顯示，EAE大鼠脊髓白質和灰質區(qū)均有Iba1⁺細胞聚集和GFAP⁺細胞的數量增加(圖3A)。統(tǒng)計分析表明，Roflumilast(1)和Roflumilast(2)組的Iba1+細胞數與Vehicle組相比顯著減少(圖3A和C)。盡管與Vehicle組相比，Roflumilast(1)和Roflumilast(2)組的GFAP⁺細胞數量都有所減少，但差異不具有統(tǒng)計學意義(圖3A和B)。

圖3 羅氟司特抑制EAE大鼠脊髓小膠質細胞炎性增殖

4、羅氟司特抑制M1小膠質細胞表型并改善EAE運動功能

根據免疫功能，小膠質細胞可分為M1型和M2型，其標志物分別為iNOS和CD206。M2亞型抑制過度炎癥，而M1亞型以病理方式促進炎癥。研究人員利用免疫熒光技術觀察羅氟司特對EAE大鼠脊髓小膠質細胞表型的影響。與陰性組相比，EAE組iNOS⁺Iba1⁺細胞和CD206⁺Iba1⁺細胞顯著增加(圖4A-C)。與Vehicle組相比，Roflumilast(2)組的iNOS⁺Iba1⁺細胞顯著減少(圖4A和B)。Roflumilast(2)組CD206⁺IBA1⁺細胞百分比有所下降，但無顯著差異(圖4A和C)。神經行為缺陷評分與iNOS⁺Iba1⁺細胞百分率呈顯著正相關(圖4D)。然而，神經行為缺陷評分與CD206⁺IBA1⁺細胞百分比的相關分析顯示無統(tǒng)計學意義(圖4E)。

圖4 羅氟司特抑制EAE大鼠脊髓小膠質細胞M1表型轉化

5、羅氟司特對腦內小膠質細胞免疫活性的影響

有文獻研究表明，大腦中的小膠質細胞參與了抑郁癥的主要發(fā)病機制，因為它們在維持中樞神經系統(tǒng)正常神經元功能方面發(fā)揮了作用，包括調節(jié)神經元死亡、突觸形成、修剪和可塑性。為探討羅氟司特對大鼠腦組織小膠質細胞活化的影響，研究人員采用流式細胞儀檢測CD45⁺CD11b⁺細胞CD80、CD86、MHC-I、MHC-II的表達水平。Vehicle組CD45⁺CD11b⁺細胞CD80、CD86、MHC-II和MHC-I的平均熒光強度與陰性組相比有統(tǒng)計學意義(圖5B-E)。Roflumilast(2)組CD45+CD11b+細胞CD80、CD86和MHC-II的中位熒光強度與Vehicle組相比，顯著降低(圖5B、C和D)。然而，Roflumilast(2)和Vehicle組的MHC-I中值熒光強度之間沒有顯著差異(圖5E)。

圖5 羅氟司特對EAE大鼠腦內小膠質細胞活化的影響

6、羅氟司特通過抑制海馬區(qū)小膠質細胞激活減輕EAE抑郁癥狀

有文獻研究表明，海馬區(qū)小膠質細胞的激活與抑郁癥密切相關。當海馬區(qū)的小膠質細胞過度激活時，它們會釋放促炎細胞因子，導致神經元凋亡和突觸喪失。小膠質細胞的形態(tài)變化可以對激活狀態(tài)和功能的改變做出反應。因此，研究人員采用Sholl分析方法觀察羅氟司特對EAE大鼠海馬區(qū)小膠質細胞形態(tài)的影響。Sholl分析表明，Vehicle組的交叉點數量與陰性組相比，顯著減少，而Roflumilast(2)組的交叉點計數明顯高于Vehicle組(圖6A和B)。此外，Vehicle組的分支指數低于陰性組，Roflumilast(2)組的分支指數顯著高于Vehicle組(圖6C)。進一步的相關分析表明，蔗糖偏好與分枝指數呈顯著正相關(圖6D)，不動時間與分枝指數呈顯著負相關(圖6E)。

圖6 羅氟司特對海馬區(qū)小膠質細胞的影響

7、海馬區(qū)IL-6表達減少與EAE誘導的抑郁癥的改善有關

研究人員使用STRING網站對與MS相關的主要19個基因進行的聚類分析表明，在最大的亞群中，IL6、IL1B和TNF表現出編碼蛋白的相互作用(圖7A)。通過GenDoma數據庫進行的進一步分析發(fā)現，IL6、IL1B和TNF是MS和抑郁癥之間常見的疾病相關基因(圖7B)?？紤]到羅氟司特是PDE4的非特異性抑制劑，利用STRING網站對PDE4相關基因與上述三個候選基因之間的相互作用進行了額外的分析。結果表明，PDE4A與IL6、IL1B、TNF相互作用，PDE4B與IL1B、TNF相互作用，PDE4D可能通過PDE4A、PDE4B影響IL6、IL1B、TNF。

先前的研究發(fā)現，抑制海馬區(qū)小膠質細胞的激活與改善EAE的抑郁癥狀有關，因此研究人員進一步分析了海馬炎性因子濃度的差異。酶聯免疫吸附分析顯示，Roflumilast(2)組大鼠海馬區(qū)IL-1β、TNF-α和IL-6濃度低于Vehicle組(圖7D-E)。 Pearson's相關分析結果顯示，海馬區(qū)IL-1β和TNF-α的濃度與不動時間(圖7G-H)或對蔗糖的偏愛(圖7J-K)之間沒有明顯的相關性。然而，海馬區(qū)IL-6濃度和不動時間之間發(fā)現了統(tǒng)計學上顯著的正相關(圖7I)，而海馬區(qū)IL-6的濃度和蔗糖偏好之間觀察到了統(tǒng)計學上明顯的負相關(圖7L)。這些發(fā)現提示，海馬區(qū)小膠質細胞和IL-6可能在EAE相關性抑郁癥的病理生理過程中起重要作用。為了研究通過抑制IL-6信號通路直接抑制EAE大鼠的抑郁癥狀，研究人員用IL-6中和抗體治療EAE。研究結果顯示，羅氟司特對EAE大鼠的抑郁有類似的緩解作用(圖7M-O)。

圖7 海馬區(qū)IL-6表達減少與緩解EAE誘導的抑郁有關

8、羅氟司特抑制BV2細胞CD80、CD86、MHC-II的表達及IL-6的釋放

研究人員通過體外實驗觀察羅氟司特對小膠質細胞免疫激活及IL-6表達的影響。結果表明，在有內毒素刺激的情況下，羅氟司特抑制BV2細胞CD80、CD86和MHC-II的表達，并抑制IL-6的釋放(圖8A-D)。

圖8 羅氟司特抑制BV2細胞激活

通過以上的研究數據，該研究團隊得出結論：羅氟司特可能用于治療多發(fā)性硬化癥患者的抑郁和運動障礙，其抗炎、減炎和抑制小膠質細胞活化的特性提示其治療多發(fā)性硬化癥的潛力。同時，研究者最后也提出該實驗的局限性：EAE模型的病理損害主要局限于脊髓組織，腦組織損害相對較輕，而MS損害可累及腦組織和脊髓組織。因此，動物實驗不能模擬人類多發(fā)性硬化癥的病理生理特征。此外，多發(fā)性硬化癥的臨床癥狀復雜多樣，包括感覺異常、共濟失調、疲勞和疼痛，這些癥狀在動物身上無法準確量化。因此，還需要進一步的研究來評估多發(fā)性硬化癥患者的長期療效和安全性。

Wang Z, Zhang Y, Chai J, Wu Y, Zhang W, Zhang Z. Roflumilast: Modulating neuroinflammation and improving motor function and depressive symptoms in multiple sclerosis[J]. J Affect Disord. 2024;350:761-773. doi:10.1016/j.jad.2023.12.074

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