AD背景介紹
阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種發(fā)病原因不明、發(fā)病機制復(fù)雜的原發(fā)性腦部神經(jīng)性疾病，是最為常見的癡呆類型之一。臨床主要表現(xiàn)為進行性記憶力下降、認知功能障礙、行為異常和人格失常等。其典型的病理改變包括神經(jīng)元丟失、β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protenin, Aβ)沉淀形成的老年斑(senile plaque, SP)及tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle, NFT)等[1]。隨著人口老齡化進程的不斷加劇，AD已成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點和焦點。
圖1 a)健康大腦；b)AD大腦中的大腦和神經(jīng)元的生理結(jié)構(gòu)[2]
AD建模方法
目前常用的AD動物模型的制備思路主要以體現(xiàn)AD病理、生理、臨床表現(xiàn)特征為導(dǎo)向，模擬AD病理特征制備模型是研究AD的重要手段。AD動物模型的建立方法主要包括衰老模型、轉(zhuǎn)基因模型、外源性有害物質(zhì)注入模型等(表1)。例如，研究人員建立了腦內(nèi)直接注射Aβ以誘發(fā)Aβ沉積的老年斑為特點的AD模型。目前主要注射的Aβ為Aβ1-42、Aβ1-40以及Aβ25-35，注射部位主要為單/雙側(cè)海馬CA1區(qū)或者側(cè)腦室，注射時間可從3天到數(shù)周不等[3-4]。其中，Aβ1-42是AD病理學(xué)研究的主要形式，它形成的核（種子）啟動了纖維的形成，導(dǎo)致了經(jīng)典的淀粉樣變性過程。
表1 常用AD動物模型的優(yōu)缺點比較
誘導(dǎo)原理 | 模型 | 優(yōu)點 | 缺點 |
衰老 | 自然衰老型 | 模型腦內(nèi)神經(jīng)元萎suo、膽堿能功能低下、認知障礙。 | 老齡動物難以大量獲得、極少神經(jīng)元纖維纏結(jié)及淀粉樣蛋白沉積、造模時間長。 |
快速老化型(SAM) | Aβ沉積、葡萄糖代謝的三羧酸循環(huán)異常、免疫功能障礙。 | 成本高、壽命較短。 | |
D-半乳糖(D-gal)模型 | 價格低廉、神經(jīng)元丟失、蛋白質(zhì)合成減少、學(xué)習(xí)記憶障礙。 | 不能產(chǎn)生AD有的老年斑和神經(jīng)纏結(jié)、不確定因素較多 | |
轉(zhuǎn)基因 | APP轉(zhuǎn)基因型 | 細胞外Aβ的沉積、神經(jīng)炎斑塊、神經(jīng)元突觸丟失。 | 無tau蛋白磷酸化及NFT，無AD海馬及皮層神丟失經(jīng)元。 |
APP/PS-1轉(zhuǎn)基因型 | 皮質(zhì)和海馬區(qū)有Aβ沉積、神經(jīng)元的改變、神經(jīng)行為學(xué)功能障礙。 | 外源性基因表達不穩(wěn)定，造模費時、繁殖力差,費用高。 | |
轉(zhuǎn)tau基因動物型 | 腦干和脊髓有NFT的形成、記憶障礙。 | 缺乏Aβ沉積 | |
外源性有害物質(zhì)注入誘導(dǎo) | Aβ注入誘導(dǎo)型 | Aβ沉積、免疫炎癥反應(yīng)、星形膠質(zhì)細胞增生、tau蛋自過度磷酸化，ChAT活性顯著下降。 | 不符合AD慢性起病的特點、Aβ聚集在注射位點局部，造模對腦組織造成非目的損傷。 |
鋁中毒誘導(dǎo)型 | Aβ聚集、神經(jīng)元變性、空間學(xué)習(xí)障礙和記憶損傷。 | 造模周期較長、中樞膽堿能活性未降低、NFT不同于AD患者。 | |
鏈脲菌素(STZ)型 | tau蛋白高度磷酸化、Aβ沉積、膽堿能的缺失、氧化應(yīng)激。 | 動物死亡率較高、無神經(jīng)纖維纏結(jié)和老年斑。 | |
東莨菪堿誘導(dǎo)型 | 方法簡便易行、費用較低、膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)障礙、認知障礙。 | 缺乏AD典型病理特征 |
下面，小愛分享用Aβ 1-42誘導(dǎo)AD模型的方法[3]。
1、Aβ1-42的配制
(1) 取出儲存于-80°C條件下的人工合成Aβ1-42凍干粉，室溫下平衡30min；
(2) 在通風(fēng)櫥內(nèi)，將 Aβ1-42懸浮于100%HFIP(1.596g/mL)中，濃度為1mM，充分混勻后分裝成等量小份；
(3) 將分裝的等量小份用真空離心蒸發(fā)濃縮器蒸發(fā)掉HFIP，蒸發(fā)后-20°C保存；
(4) 使用前，將上述-20°C保存的小份Aβ1-42重懸于DMSO中，濃度為5mM；
(5) 使用時，按實驗需要用生理鹽水或者人工腦脊液稀釋至實驗濃度。
2、小鼠單側(cè)側(cè)腦室埋管
(1) 小鼠吸入異氟烷麻醉后，固定于小鼠腦立體定位儀上；
(2) 用75%酒精對頭部顱頂消毒，剃毛后再次消毒；
(3) 剪開頭皮，暴露顱骨，雙氧水去除顱骨表面的結(jié)締組織。顱骨干燥后，再次消毒；
(4) 利用立體定位儀將定位針指向前囟門(Bregma)并作為起始點，移動定位針確定套管位置（前囟前0.46mm、顱骨中線左右各旁開1mm、深2.3mm），用顱骨鉆鉆孔，左右側(cè)腦室隨機放置套管（套管直徑0.48mm、內(nèi)芯直徑0.3mm）；
(5) 用骨膠粘合套管與顱骨之間的縫隙，骨膠干燥后用牙科水泥將套管固定在顱骨上；
(6) 將小鼠轉(zhuǎn)移至電熱毯上，蘇醒后放回飼養(yǎng)盒中，單籠單只飼養(yǎng)；
(7) 注射藥物時，拔出導(dǎo)管內(nèi)芯，用適宜長度PE管連接小鼠腦部套管和微量注射針，微量注射泵注射速度為0.5μL/min。
3、行為學(xué)任務(wù)
任務(wù)開始前對各組已完成套管埋置的小鼠注射生理鹽水或者Aβ1-42，微量注射泵注射速度為0.5μL/min，注射2μL。注射完后停針5min防止注射液倒流，然后放回內(nèi)芯，鎖緊螺帽。自發(fā)轉(zhuǎn)換Y迷宮實驗和新異位置識別任務(wù)：小鼠注射藥物10min后，開始自發(fā)轉(zhuǎn)換Y迷宮實驗和新異位置識別任務(wù)的檢測。
AD驗證方法
理想的模型應(yīng)至少具備以下三個特征：
①具有AD的主要病理學(xué)特征：SP和NFP。
②出現(xiàn)AD的重要病理變化：神經(jīng)元死亡、神經(jīng)突觸丟失和星形膠質(zhì)細胞增生等。
③出現(xiàn)認知功能障礙。
在AD的基礎(chǔ)研究和藥物發(fā)現(xiàn)中，小鼠模型是揭示生物學(xué)機制、驗證分子靶點和篩選潛在化合物的重要資源。轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠模型都可以在體內(nèi)獲得不同類型的AD樣病理。盡管有大量關(guān)于AD致病途徑的遺傳和生化研究，但作為一種以認知障礙為主要特征的疾病，任何干預(yù)措施的最終讀數(shù)都應(yīng)該是學(xué)習(xí)和記憶的檢測[4]。
AD小鼠模型行為分析常用的測試實驗包括：情境恐懼條件反射、放射臂水迷宮和Morris水迷宮(圖2&3&4)。下面小愛以文獻[4]為例，詳細介紹情境恐懼條件反射實驗設(shè)備及操作步驟。
小鼠在一個調(diào)理室中進行單獨測試(圖2)，該調(diào)理室位于一個帶有透明有機玻璃窗口的音效衰減箱中，可以對實驗進行視頻記錄。調(diào)整室有一個36bar的隔震格柵地板，地板是可拆卸的，在每個實驗對象之后，用75%的乙醇清洗，然后再用水清洗。為了提供背景白噪聲(72dB)，在音量衰減室的一側(cè)安裝了單個計算機風(fēng)扇。
在行為實驗之前，每天處理一次小鼠，連續(xù)3天。試驗室里一次只放一只動物。將其放置在調(diào)理室中2min，然后以2800Hz和85dB的頻率發(fā)出離散音調(diào)(CS)30s。在音調(diào)的最后2s內(nèi)，鼠標通過地板條受到腳部電擊（US，0.50-0.80mA，持續(xù)2s），可調(diào)節(jié)足部電擊的強度來引發(fā)更強的記憶。在CS/US配對之后，將小鼠在調(diào)理室中再放置30s，然后將其放回籠子中。凍結(jié)行為可以通過使用專用軟件進行評分。根據(jù)經(jīng)驗，通過手動評分凍結(jié)時間進行雙重檢查非常有用。訓(xùn)練24h后，將小鼠放回條件反應(yīng)室。凍結(jié)時間為連續(xù)5min。在訓(xùn)練后36h將小鼠更換為條件箱。通過插入一個三角形籠子來創(chuàng)造一個新的環(huán)境，籠子的地板是光滑的，帶有香草氣味。2min后（CS前測試），將小鼠暴露在與訓(xùn)練中使用的音調(diào)特征相同的音調(diào)中3min（CS測試），并測定凍結(jié)時間。通常在每種情況下使用15-20只動物。
在測試恐懼記憶的過程中需要進行的一個重要控制是感覺閾值評估。對電擊的感官知覺的改變可能是由于實驗操作導(dǎo)致對觀察到的表型記憶的錯誤歸因。將一系列單腳電擊傳遞給放置在恐懼條件所用相同電網(wǎng)上的動物。最初，0.1mA的電擊持續(xù)1s，評估動物的退縮、跳躍和發(fā)聲行為。每隔30s，沖擊強度增加0.1-0.7mA，然后每隔30s以0.1mA的增量恢復(fù)到0mA。通過平均每只動物對足部電擊表現(xiàn)出行為反應(yīng)的電擊強度，對每只動物的發(fā)聲、退縮和跳躍閾值進行量化。
AD的治療
據(jù)報道，目前全球阿爾茨海默病病例約為2400萬例，2050年，癡呆癥患者總數(shù)估計將增加4倍。盡管AD是一個公共衛(wèi)生問題，但到目前為止，只有兩類藥物被批準用于治療AD，包括膽堿酯酶抑制劑（天然衍生、合成和雜交類似物）和N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗劑[5]。
AD的幾個生理過程會破壞乙酰膽堿生成細胞，減少膽堿能通過大腦的傳遞。乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEIs)分為可逆性、不可逆性和偽可逆性，通過阻斷膽堿酯酶(AChE)和丁基膽堿酯酶(BChE)分解ACh，導(dǎo)致突觸間隙中ACh水平增加而發(fā)揮作用。另一方面，NMDAR的過度激活導(dǎo)致內(nèi)流的鈣離子水平增加，從而促進細胞死亡和突觸功能障礙。NMDAR拮抗劑阻止NMDAR谷氨酸受體的過度激活，從而阻止鈣離子內(nèi)流，并恢復(fù)其正?；顒?。盡管這兩類藥物有療效，但它們只對治療阿爾茨海默病的癥狀有效，但不能治愈或預(yù)防這種疾病。
圖5 已被批準用于治療AD的小分子藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式
建立理想的動物模型模擬人類疾病狀態(tài)有利于開展AD病因、發(fā)病機制及防治的深入研究。目前由于無法建立很好的AD動物模型，所以在進行藥物篩選時，同時用兩種或兩種以上AD動物模型比用單一模型更有說服力，同時也可進一步證實藥物的有效性。
參考文獻
[1] Puzzo D, Gulisano W, Palmeri A, et al. Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery[J]. Expert opinion on drugdiscovery, 2015, 10(7):703-711.
[2] Breijyeh Z, Karaman R. Comprehensive Review on Alzheimer's Disease: Causes and Treatment [J]. Molecules, 2020, 25, (24).
[3] 呂君妍. Aβ1-42或Aβ1-15改善APP/PS1/Tau轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默癥小鼠記憶的機制[D]. 華東師范大學(xué), 2023.
[4] A D P, B L L, A A P,et al.Behavioral assays with mouse models of Alzheimer's disease: Practical considerations and guidelines-ScienceDirect[J]. Biochemical Pharmacology, 2014, 88( 4):450-467.
[5] Breijyeh Z, Karaman R,Comprehensive Review on Alzheimer's Disease: Causes and Treatment[J]. Molecules, 2020, 25:5789
AD造模相關(guān)產(chǎn)品推薦
貨號 | 品名 | 規(guī)格 |
abs45128173 | Amyloid β-Protein(1-42) | 1mg |
abs44056601 | Amyloid β-Protein(1-40) | 1mg |
abs45151799 | Amyloid β-Protein(25-35) | 1mg |
abs816779 | D-Galactose(D-半乳糖) | 500mg |
abs812888 | Streptozocin(鏈脲菌素) | 100mg |
abs47000420 | Scopolamine(東莨菪堿) | 50mg |
abs9839 | 人工腦脊液(ACSF,無菌) | 500mL |
AD治療小分子化合物推薦
貨號 | 品名 | 規(guī)格 | 作用 |
abs817977 | Donepezil HCl(鹽酸多奈哌齊) | 5mg | 膽堿酯酶(AChE)抑制劑 |
abs816566 | Rivastigmine(卡巴拉汀) | 50mg | 膽堿酯酶(AChE)抑制劑 |
abs822010 | Galanthamine(加蘭他敏) | 100mg | 膽堿酯酶(AChE)抑制劑 |
abs816243 | Memantine hydrochloride(鹽酸美金剛胺) | 500mg | N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮抗劑 |
Absin產(chǎn)品線：
爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測、殘留檢測、多因子檢測)；細胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
8
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務(wù)