在腫瘤免疫治療領(lǐng)域，特異性T細(xì)胞療法跟傳統(tǒng)治療方法顯著不同，具有顯著的抗腫瘤效果，被認(rèn)為是癌癥治療的有效方案之一。其中，小鼠T細(xì)胞特異性識(shí)別腫瘤抗原的特異性T細(xì)胞免疫療法在抗腫瘤治療領(lǐng)域具有重要作用。Absin新推出的小鼠腫瘤抗原特異性T細(xì)胞檢測(cè)刺激試劑盒是一款專門用于小鼠體內(nèi)腫瘤特異性T細(xì)胞檢測(cè)和分析的試劑盒。該試劑盒基于先進(jìn)的免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)提供特定的腫瘤抗原刺激劑，刺激T細(xì)胞增殖和活化，最終通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或ELISPOT定量檢測(cè)激活的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞含量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗腫瘤藥物或腫瘤疫苗的效果評(píng)價(jià)。

多樣本檢測(cè)，包括：

1）小鼠外周血免疫細(xì)胞中的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的含量；
2）小鼠脾細(xì)胞中的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的含量；
3）小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞中的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的含量；
4）小鼠腫瘤組織細(xì)胞中的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的含量；

圖1 腫瘤抗原特異性T細(xì)胞

一、產(chǎn)品介紹

腫瘤抗原特異性T細(xì)胞是殺傷癌細(xì)胞的主力，由于癌細(xì)胞和腫瘤抗原的高度異質(zhì)性，癌細(xì)胞沒(méi)有一種或多種占主導(dǎo)的抗原，因此也就沒(méi)有幾種占主導(dǎo)的抗原特異性T細(xì)胞，而傳統(tǒng)的使用幾種多肽抗原或MHC四聚體技術(shù)等檢測(cè)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞時(shí)，只能檢測(cè)針對(duì)幾種已知特定抗原的抗原特異性T細(xì)胞，導(dǎo)致檢測(cè)的抗原特異性T細(xì)胞不全面、不準(zhǔn)確。

該試劑盒檢測(cè)納米顆粒負(fù)載癌細(xì)胞的全細(xì)胞抗原，抗原種類全面、多樣和廣譜，可全面準(zhǔn)確檢測(cè)不同組織中的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞。具有特異性高，準(zhǔn)確性高，所檢測(cè)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞種類全面等優(yōu)點(diǎn)。

二、產(chǎn)品分類&組成

三、使用方法&檢測(cè)步驟

1、在細(xì)胞培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加入待檢測(cè)細(xì)胞和相應(yīng)的培養(yǎng)基，細(xì)胞濃度0.8*10⁶-5*10⁶個(gè)細(xì)胞/mL，考慮到細(xì)胞損失和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確性，建議至少使用100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞以上，建議使用12孔或24孔板培養(yǎng)，至少使用1-2mL以上培養(yǎng)基；

2、向其中加入使用PBS或相應(yīng)培養(yǎng)基重懸后的納米粒子；（本檢測(cè)試劑盒中檢測(cè)納米粒子使用終濃度為0.5mg/mL-1.0mg/mL）

3、納米粒子與待檢測(cè)細(xì)胞共孵育32-48h；

4、在培養(yǎng)基中加入Brefeldin A Solution (BFA) (1000*稀釋到細(xì)胞培養(yǎng)基中)，共孵育4h；

5、使用移液器吹打收集培養(yǎng)基中的懸浮細(xì)胞，收集完細(xì)胞后將樣品細(xì)胞在400-500g離心5min，棄去上清液后收集細(xì)胞；

6、收集完細(xì)胞后將樣品細(xì)胞重懸于1mL PBS中；

7、除空白對(duì)照之外，每個(gè)樣品加入2μL活死細(xì)胞染料標(biāo)記活細(xì)胞和死細(xì)胞，混合均勻，冰上避光孵育15-30min；

8、孵育完畢后，400-500g離心5min，用100μL FACS buffer重懸細(xì)胞；

9、除空白對(duì)照之外。每個(gè)樣品中加2μL Fc Block封閉免疫細(xì)胞表面的Fc受體，混勻后冰上孵育5min；

10、孵育完畢后，每管加入相應(yīng)的不同熒光染料標(biāo)記的膜標(biāo)記抗體CD3抗體、CD4抗體、CD8抗體，冰上孵育15-30min；

11、直接加入500μL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，冰上孵育40-60min；

12、400-500g離心5min，棄去上清液，然后加100μL破膜劑重懸細(xì)胞，冰上孵育30min；

13、孵育完畢后，每管加入相應(yīng)的熒光染料標(biāo)記的IFN-γ抗體，冰上孵育30min；

14、400-500g離心5min，棄去上清后用200μL FACS buffer 重懸細(xì)胞或者使用500μL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，冰上孵育40-60min后再檢測(cè)；

15、使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所標(biāo)記抗體為陽(yáng)性的細(xì)胞比例；（注：上機(jī)檢測(cè)時(shí)需先過(guò)400目濾布之后再檢測(cè)）

16、使用流式細(xì)胞術(shù)分析軟件分析活細(xì)胞中的CD3+IFN-γ+ 、CD3+CD4+IFN-γ+和CD3+CD8+IFN-γ+的T細(xì)胞占相應(yīng)細(xì)胞的比例，即為腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的比例和含量（細(xì)胞越多檢測(cè)越準(zhǔn)確。建議檢測(cè)時(shí)活細(xì)胞收取數(shù)大于10萬(wàn)，最好收集的活細(xì)胞數(shù)大于20萬(wàn)）。

四、注意事項(xiàng)

1、本產(chǎn)品僅為體外檢測(cè)用產(chǎn)品，不可食用，也不可注射使用等；請(qǐng)放置在遠(yuǎn)離兒童可及的范圍；
2、現(xiàn)配現(xiàn)用，一旦使用培養(yǎng)基或PBS重懸納米顆粒后立即加入待檢測(cè)細(xì)胞中混合；
3、使用過(guò)程中可根據(jù)需要自由搭配所使用的不同抗體的熒光探針；
4、請(qǐng)將固定后的細(xì)胞放置在4℃并于一周內(nèi)完成檢測(cè)；
5、本產(chǎn)品只適用于小鼠樣本的檢測(cè)。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、使用負(fù)載B16F10腫瘤組織全細(xì)胞抗原的納米粒、負(fù)載8種B16F10的新抗原多肽的納米粒、以及游離的B16F10腫瘤組織裂解液分別與小鼠脾細(xì)胞單細(xì)胞懸液共孵育激活腫瘤抗原特異性T細(xì)胞后，在CD3+T細(xì)胞中可以表達(dá)IFN-γ的T細(xì)胞比例，如下圖所示。

圖2 負(fù)載B16F10腫瘤組織全細(xì)胞抗原的納米粒

圖3 游離的B16F10腫瘤組織裂解液

圖4 負(fù)載8種B16F10的新抗原多肽的納米粒

2、小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞和脾臟細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果，如下圖所示。

圖5 小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞和脾臟細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果圖

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