描述：

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí), 會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組 DNA，產(chǎn)生180bp-200bp的DNA片段，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)的特異的梯狀Ladder圖譜。基因組 DNA 雙鏈或單鏈斷裂時(shí)會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)生大量的粘性 3'- OH 末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化作用下，與488/Cy-dUTP結(jié)合，從而通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀直接進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有 DNA 的斷裂，因而沒有 3'-OH 形成，很少能夠被染色。Tunel 法可以對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中廣泛采用。 

本試劑盒應(yīng)用范圍廣，可用于檢測(cè)冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可檢測(cè)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況?？蛇x擇性的檢測(cè)凋亡細(xì)胞，而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細(xì)胞。本試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，耗時(shí)短，只需一步染色反應(yīng)，洗滌后即可檢測(cè)。

使用方法：

一、實(shí)驗(yàn)材料（自備）
 PBS緩沖液(1×,pH~7.4)、0.2% Triton X-100（PBS配制）、0.1%Triton X-100（PBS配制，其中含5mg/mL BSA）、4%多聚甲醛（PBS配制）、免疫組化筆、脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）、石蠟切片處理相關(guān)試劑、抗熒光淬滅封片劑、ddH2O

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

A.陽(yáng)性對(duì)照：
DNase I 處理制備陽(yáng)性對(duì)照載玻片。DNase I 可以消化單鏈或雙鏈 DNA 產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶，人為造成細(xì)胞凋亡。
B.陰性對(duì)照：
使用不含 TdT Enzyme 的 TUNEL Reaction Buffer，用 ddH2O 替代 TdT Enzyme。
C.實(shí)驗(yàn)處理組。
D.實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。

三、實(shí)驗(yàn)步驟:

1、樣本準(zhǔn)備：
（1）對(duì)于貼壁細(xì)胞或細(xì)胞涂片
     a. PBS 清洗 1 次。
     注：如果擔(dān)心細(xì)胞涂片的細(xì)胞貼得不牢，可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢。
     b. 固定：加入適量 4%多聚甲醛（PBS 配制），4°C固定 30 min。PBS 清洗 2 次。
     c. 通透：加入適量 0.2% Triton X-100（PBS 配制），室溫通透 20 min。PBS 清洗 2 次。
     d.轉(zhuǎn)步驟 2. TUNEL 反應(yīng)。

（2）對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液
     a. 收集細(xì)胞（3-5×106個(gè)細(xì)胞），1000 rpm 離心 5 min，PBS 清洗 2 次。
     b. 固定：加入適量 4%多聚甲醛（PBS 配制）充分重懸細(xì)胞，4℃固定 30 min。2000 rpm 離心 5 min，PBS 清洗 2 次。
     c. 通透：加入適量 0.2% Triton X-100（PBS 配制），室溫通透 20 min。2000 rpm 離心 5 min，PBS 清洗 2 次。
     d. 轉(zhuǎn)步驟 2. TUNEL 反應(yīng)。

（3）石蠟組織切片
     a.  脫蠟與水化：將切片樣本依次放入二甲苯 I（10 min）→ 二甲苯 II（10 min）→ 100％乙醇 I（5 min）→ 100％乙醇 II（5 min）→ 95%乙醇（5 min）→ 90%乙醇（5 min）→ 80%乙醇（5 min）→ 70%乙醇（5 min）→ ddH2O 沖洗 5 min，沖洗 2 次。
      注：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請(qǐng)?jiān)谕L(fēng)櫥中進(jìn)行此操作。
     b. 用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標(biāo)記。
     注：若在后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時(shí)補(bǔ)畫。
     c. 通透：按 1: 100 的比例，將 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 PBS 稀釋至終濃度 20 µg/mL，在每個(gè)樣本上滴加 100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，20-37℃孵育 20 min。
     注：Proteinase K 可通透細(xì)胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高標(biāo)記效率。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn)，過(guò)短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K 的濃度、孵育時(shí)間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化。
     d. PBS 漂洗切片 2 次，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤(rùn)。
     注：這一步必須把 Proteinase K 洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。
e. 轉(zhuǎn)步驟 2. TUNEL 反應(yīng)。

（4）冰凍組織切片
     a. 固定：取出冰凍切片，并回溫至室溫。加入適量 4%多聚甲醛（PBS 配制），室溫固定 30 min。PBS 漂洗 2 次，每次 10 min。
     b. 用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標(biāo)記。
      注：若在后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時(shí)補(bǔ)畫。
     c. 通透：按 1: 100 的比例，將 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 PBS 稀釋至終濃度 20 µg/mL，在每個(gè)樣本上滴加 100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，20-37℃孵育 20 min。
      注：Proteinase K 可通透細(xì)胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高標(biāo)記效率。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn)，過(guò)短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K 的濃度、孵育時(shí)間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化。
      d. PBS 漂洗切片 2 次，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤(rùn)。
       注：這一步必須把 Proteinase K 洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。
       e. 轉(zhuǎn)步驟 2. TUNEL 反應(yīng)。

（5）陽(yáng)性處理（僅陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行此步驟，其他樣品直接進(jìn)行 TUNEL 反應(yīng)步驟）
       a. 按 1: 10 的比例用 ddH2O 將 10× DNase I Buffer 稀釋成 1× DNase I Buffer 備用。
       b. 滴加 100 µL 1×DNase I Buffer 到已處理的樣本上，覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫平衡 5 min。
       c. 用 1×DNase I Buffer 以 1: 100 稀釋 DNase I (2 U/μL)至終濃度 20 U/mL 的工作液。
       d. 棄去 Buffer，加入 100 μL 濃度為 20 U/mL 的 DNase I 工作液，室溫孵育 10 min。
       e. 棄去 DNase I 工作液，PBS 清洗 2 次。
       f. 轉(zhuǎn)步驟 2. TUNEL 反應(yīng)。

2、TUNEL 反應(yīng)
（1）配制 TUNEL 反應(yīng)液（即用即配）：

（2）對(duì)于貼壁細(xì)胞、細(xì)胞涂片或組織切片
      a. 每個(gè)樣本加入 50 μL TUNEL 反應(yīng)液，使反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育適宜的時(shí)間（細(xì)胞推薦染色時(shí)間 30min-1h，組織染色時(shí)間推薦 2h）。
       注：50 μL TUNEL 反應(yīng)液適合涂片、切片或 96 孔板（其他不同孔板可以適當(dāng)調(diào)整 TUNEL 反應(yīng)液體積，覆蓋細(xì)胞即可）。
      如果待檢測(cè)的樣品為涂片、切片或在 24 孔板、12 孔板或 6 孔板中，可以使用防蒸發(fā)膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當(dāng)材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加 TUNEL 反應(yīng)液后覆蓋在樣品上，可以防止 TUNEL 反應(yīng)液蒸發(fā)，并且使TUNEL 反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。
     b. 棄去 TUNEL 反應(yīng)液，PBS 漂洗 2 次，再用 0.1% Triton X-100（PBS 配制，其中含 5 mg/mL BSA）漂洗 3 次，每次 5 min，這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清除較干凈。
     c.（可選）每個(gè)樣本加入適量濃度為 5 μg/mL 的 DAPI 染液，室溫避光孵育 5 min。染色完成后，棄去 DAPI 染液，PBS 漂洗 2 次，每次 5 min。
     d.（可選）切片封片：每個(gè)樣本滴加 50 μL 抗熒光淬滅封片劑（抗熒光淬滅封片劑可能會(huì)不適用于某些染料，實(shí)驗(yàn)前建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試匹配性），蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片。       
     e.  用濾紙吸去多余的液體，向樣本區(qū)域加 100 μL PBS 保持樣本濕潤(rùn)，立即在熒光顯微鏡下觀察。

（3）對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液
       a. 每個(gè)樣本管加入 50 μL TUNEL 反應(yīng)液輕輕重懸細(xì)胞，37℃避光孵育 30~60 min。每隔 15 min 用微量移液器輕輕重懸細(xì)胞。
       b.  2000 rpm 離心 5 min，棄去 TUNEL 反應(yīng)液，加入適量 0.1% Triton X-100（PBS 配制，其中含 5 mg/mL BSA）輕輕重懸細(xì)胞，并清洗 2 次，每次5min，這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清楚較干凈。
      c. 每個(gè)樣本管加入 100 μL 濃度為 5 μg/mL 的 DAPI 染液，室溫避光孵育 5 min。
      d. 加入 400 μL PBS 重懸細(xì)胞，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)或進(jìn)行涂片后在熒光顯微鏡下觀察。

注意事項(xiàng)：

1、使用前請(qǐng)將產(chǎn)品瞬時(shí)離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 
2、染色背景較重或非特異性著色明顯時(shí)可適當(dāng)減少染色時(shí)間。 
3、實(shí)驗(yàn)時(shí)建議增加陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組。 
4、組分 A 使用時(shí)請(qǐng)佩戴口罩、手套，如接觸皮膚，請(qǐng)立即用大量水沖洗。 
5、熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。 
6、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

產(chǎn)品引用文獻(xiàn)：

Low-temperature photothermal-induced alkyl radical release facilitates dihydroartemisinin-triggered "valve-off" starvation therapy

Xiaomin Su, Boshu Ouyang, Yao Liu, Yang Wang, Ruizhe Xu, Lili Niu, NanNan Li, Ce Xu, Zanya Sun, Huishu Guo, Zhiqing Pang, Xiangrong Yu

Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2023 Sep 30 .

影響因子： 10.2

Cold atmospheric plasma fumigation suppresses postharvest apple Botrytis cinerea by triggering intracellular reactive oxygen species and mitochondrial calcium

Jiankang Cao, Qiong Fang, Chenrui Han, Chongshan Zhong

INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY. 2023 Sep 11 .

影響因子： 5.4

Multimodal investigation reveals the neuroprotective mechanism of Angong Niuhuang pill for intracerebral hemorrhage: Converging bioinformatics, network pharmacology, and experimental validation

Jiawei Zhou, Tianlin Jiang, Jiahua Wang, Weilan Wu, Xiaochun Duan, Huiyun Jiang, Zhiyun Jiao, Xiaohong Wang

JOURNAL OF ETHNOPHARMACOLOGY. 2023 Aug 24 .

影響因子： 5.4