• 使用人類多能誘導(dǎo)干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞形成肝細(xì)胞球

• 對(duì)體外篩選的3D模型進(jìn)行肝毒性評(píng)價(jià)

• 3D圖像分析過程中對(duì)目標(biāo)樣品進(jìn)行識(shí)別和分割，以達(dá)到*分割效果

背景介紹：

在發(fā)育生物學(xué)和組織生物學(xué)中，3D細(xì)胞球建模方式能夠加快轉(zhuǎn)化研究進(jìn)程，因此越來越受到人們的重視。如何對(duì)3D樣本進(jìn)行更高通量的定量分析成為了熱門研究課題。

在本實(shí)例中，MD公司建立并優(yōu)化了一種分析方法，能夠?qū)θ祟惗嗄苷T導(dǎo)干細(xì)胞來源的3D肝細(xì)胞球進(jìn)行共聚焦成像和毒性評(píng)估（圖1）。

使用免洗染色法進(jìn)行肝毒性評(píng)價(jià)：

1. 用肝毒性測(cè)試化合物處理細(xì)胞球72小時(shí)

2. 用溶解于無菌PBS中的三種熒光染料對(duì)細(xì)胞球進(jìn)行染色。三種染料的濃度分別為：

• 2 μM calcein AM

• 3 μM EthD-1

• 10μM Hoechst 33342 (Life Technologies)

此外，為了評(píng)價(jià)化合物對(duì)凋亡信號(hào)的激活和對(duì)線粒體形態(tài)的影響，所用的染料濃度分別為：

• 7.5 μM CellEvent Caspase 3/7

• 200 nM MitoTracker Orange (Life Technologies)

肝細(xì)胞球的形成：

本實(shí)例使用的細(xì)胞為：

• 人類多能誘導(dǎo)干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞 iCell Hepatocytes 2.0 (Cellular Dynamics International)

• HepG2細(xì)胞 (ATCC)

操作流程

1. 按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程將凍存細(xì)胞復(fù)蘇；

2. iCell Hepatocytes 2.0 鋪板進(jìn)行2D培養(yǎng)；

3. 貼壁細(xì)胞用Accutase酶消化后與Geltrex 基質(zhì)(ThermoFisher Scientific)混合，細(xì)胞混合液以1000 cells/well的密度種植在低吸附成球孔板中(InSphero or Corning)；

4. 將孔板以300 g轉(zhuǎn)速離心2分鐘使細(xì)胞沉淀并去掉基質(zhì)中的氣泡，然后將孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37°C, 5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞無需加入基質(zhì)；

5. 培養(yǎng)24–48小時(shí)后細(xì)胞球形成。

將染料加入細(xì)胞球培養(yǎng)體系中孵育2小時(shí)，然后采集圖像。染料無需洗脫，加樣過程小心謹(jǐn)慎，避免損傷細(xì)胞球進(jìn)而造成細(xì)胞球解體或偏離原位。典型的細(xì)胞球染色結(jié)果如圖 2所示。

高通量3D圖像的采集和分析過程：

采用ImageXpress® Micro 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)(Molecular Devices)采集圖片，具體設(shè)置如下：

• 物鏡種類--10倍鏡和20倍鏡

• 層掃間距--5-10μm

• 層掃范圍--100-120μm

• 層掃起始位置--多孔板孔底

所有的結(jié)果中都包含有2D maximum投射圖像，分析過程中可以對(duì)這些圖像進(jìn)行保存和調(diào)用。

識(shí)別并分析3D樣品

使用MetaXpress® 高內(nèi)涵圖像采集分析軟件對(duì)3D圖像進(jìn)行分析。CME用戶模塊編輯器中新增了3D分析模塊(圖3) ，該模塊能夠?qū)?D結(jié)構(gòu)的體積、熒光強(qiáng)度、距離等參數(shù)進(jìn)行量化并對(duì)圖像進(jìn)行批量分析。其中 “Find Spherical Objects”功能可以對(duì)目標(biāo)結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)參數(shù)（zui小和目前較大寬度，zui小和目前較大Z軸層數(shù)）和目標(biāo)結(jié)構(gòu)與背景之間熒光強(qiáng)度的差值進(jìn)行自定義設(shè)置，對(duì)不同大小的目標(biāo)結(jié)構(gòu)（小到細(xì)胞器，大到多細(xì)胞團(tuán)）進(jìn)行定義。比如將形態(tài)參數(shù)設(shè)定為：

• 細(xì)胞核寬度范圍--5-15 μm

• 細(xì)胞核層數(shù)--1-2層

• 細(xì)胞核與背景的熒光強(qiáng)度差--200 熒光單位

• 肝細(xì)胞球?qū)挾确秶?-100-300 μm

• 肝細(xì)胞球?qū)訑?shù)--5-7層

• 肝細(xì)胞球與背景的熒光強(qiáng)度差-- 400 熒光單位

分析結(jié)果包括每個(gè)目標(biāo)結(jié)構(gòu)的球體體積、直徑（或平均體積、平均直徑），以及特定熒光通道中球體的總熒光強(qiáng)度和平均熒光強(qiáng)度等參數(shù)。

“Find Spherical Objects”功能還可用于識(shí)別單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞核或利用適當(dāng)?shù)奶卣鲗⒉煌膯渭?xì)胞區(qū)別開來。此外，3D分析模塊可以按照用戶自定義選項(xiàng)“Connect by BestMatch”, “Connect byTouching”, 和 “Do NotConnect Objects”將不同層面的目標(biāo)結(jié)構(gòu)連接起來。

首先對(duì)Z軸層掃中的每層圖片按照2D圖片進(jìn)行分割、分析并得到細(xì)胞核個(gè)數(shù)，細(xì)胞死/活和細(xì)胞分類等參數(shù)的測(cè)量值；其次利用用戶定義的目標(biāo)結(jié)構(gòu)的目前較大范圍將其連接起來。如：

• 細(xì)胞核目前較大范圍 3-6 μm

• 細(xì)胞質(zhì)目前較大范圍 20-30 μm

zui終，在3D結(jié)構(gòu)中將細(xì)胞核或單細(xì)胞分割出來。整個(gè)過程中目標(biāo)結(jié)構(gòu)不會(huì)丟失也不會(huì)被重復(fù)計(jì)數(shù)。所有的細(xì)胞（如：calceinAM 陽(yáng)性/陰性細(xì)胞；Ethidium homodimer陽(yáng)性/陰性細(xì)胞）都會(huì)被識(shí)別、被計(jì)數(shù)。

為了直觀表現(xiàn)目標(biāo)結(jié)構(gòu)的整體/平均熒光強(qiáng)度、體積、直徑、間距以及目標(biāo)結(jié)構(gòu)在三維空間中的定位等參數(shù)，可用不同顏色標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞。利用細(xì)胞球標(biāo)記范圍（ spheroid masking ）對(duì)更小的結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)數(shù)，這些結(jié)構(gòu)可能在標(biāo)記范圍（mask）之中或在標(biāo)記范圍（mask）之外。如：對(duì)每孔只含有一個(gè)細(xì)胞球的樣品進(jìn)行分析時(shí)，利用單細(xì)胞標(biāo)記（ single-cell masking ）可以對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并將位于細(xì)胞球中和細(xì)胞球外的細(xì)胞區(qū)別開來。當(dāng)細(xì)胞球不完整時(shí)，這種圖形處理方式就顯得十分重要。對(duì)每孔含有多個(gè)細(xì)胞球的樣品（細(xì)胞球與基質(zhì)共培養(yǎng)）進(jìn)行分析時(shí)，這種圖形處理方式可以定義每個(gè)細(xì)胞球的容量并得出均值。

圖 4A 顯示了不同層面的2D圖像中 calceinAM 陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞分類結(jié)果。利用“Connect by Best Match” 功能可以將細(xì)胞在3D空間中連接起來。相同的方法可以分析 ethidium homodimer 陽(yáng)性/陰性細(xì)胞(細(xì)胞死/活分析) 也可以分析線粒體、熒光強(qiáng)度、細(xì)胞凋亡還可以分析特定染料和標(biāo)記物。

使用多參數(shù)表型篩選結(jié)果進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)

利用多種肝毒素處理細(xì)胞球，觀察細(xì)胞球表型和細(xì)胞含量的顯著變化。許多細(xì)胞球失去了球狀結(jié)構(gòu)，球體發(fā)生崩解，細(xì)胞球變得松散、扁平、不規(guī)則。細(xì)胞從主體結(jié)構(gòu)中脫離，或出現(xiàn)凝結(jié)核，表明細(xì)胞已經(jīng)死亡。 當(dāng)化合物濃度超過一定范圍，細(xì)胞表型就會(huì)出現(xiàn)上述變化 (圖4B)。 利用圖像量化分析得到的參數(shù)對(duì)細(xì)胞球的形態(tài)特征、細(xì)胞含量和結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度進(jìn)行評(píng)估。檢測(cè)細(xì)胞球體積、直徑、熒光強(qiáng)度，同時(shí)檢測(cè)calcein AM 陽(yáng)性細(xì)胞(活細(xì)胞)、EthD-1 陽(yáng)性細(xì)胞（死細(xì)胞）個(gè)數(shù)。細(xì)胞球經(jīng)化合物處理后，細(xì)胞總數(shù)沒有變化，死細(xì)胞數(shù)量上升，活細(xì)胞數(shù)量下降（具有濃度依賴特性）；細(xì)胞球和單個(gè)細(xì)胞（細(xì)胞質(zhì)）中calcein AM的平均熒光強(qiáng)度顯著降低。

為進(jìn)一步研究細(xì)胞毒性機(jī)制，我們對(duì)細(xì)胞的凋亡特征和線粒體完整性進(jìn)行評(píng)估?；衔锾幚砑?xì)胞球24小時(shí)后用caspase 3/7 熒光染料檢測(cè)細(xì)胞凋亡的活化程度。 caspase 3/7 對(duì)細(xì)胞球（經(jīng)甲基汞處理的對(duì)照組細(xì)胞球）的染色結(jié)果如圖2B所示。用化合物處理細(xì)胞球后會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致 caspase 3/7 熒光強(qiáng)度增加，caspase 3/7 陽(yáng)性細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）的個(gè)數(shù)增加。 用MitoTracker Orange 熒光染料染色結(jié)果來反映線粒體膜電位的變化情況。用化合物處理細(xì)胞球后會(huì)破壞線粒體結(jié)構(gòu)的完整，進(jìn)而導(dǎo)致MitoTracker Orange熒光強(qiáng)度降低（具有濃度依賴特性，圖2C ）

對(duì)活細(xì)胞個(gè)數(shù)、 calcein AM 熒光強(qiáng)度、 calceinAM 陽(yáng)性細(xì)胞含量等參數(shù)進(jìn)行測(cè)量后發(fā)現(xiàn)這些參數(shù)都的符合四參數(shù)劑量反應(yīng)曲線模型(圖 4B)。IC50 值 (表 2) 由SoftMax® Pro 6 軟件(MolecularDevices)生成。

總結(jié)：

在對(duì)肝毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)的過程中，3D肝臟球模型+高內(nèi)涵3D分析模式作為一種反應(yīng)靈敏、可重復(fù)性高的方法，越來越展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。該方法預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率相比于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)仍需要繼續(xù)完善。相關(guān)模型的進(jìn)一步發(fā)展，檢測(cè)方法的進(jìn)一步優(yōu)化有利于拓展該方法在體外篩選領(lǐng)域中的應(yīng)用空間。

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